Der nördliche Klecks ist eine in der molekularen Biologie-Forschung verwendete Technik, um Genausdruck durch die Entdeckung der RNS zu studieren (oder hat mRNA isoliert) in einer Probe. Mit dem nördlichen Beflecken davon ist möglich, Zellkontrolle über die Struktur und Funktion durch die Bestimmung der besonderen Genausdruck-Niveaus während der Unterscheidung, morphogenesis, sowie anomalen oder kranken Bedingungen zu beobachten. Das nördliche Beflecken ist mit dem Gebrauch der Elektrophorese verbunden, um RNS-Proben durch die Größe zu trennen, und Entdeckung mit einer Kreuzung dringen ergänzend zu einem Teil oder der kompletten Zielfolge forschend ein. Der Begriff 'nördlicher Klecks' bezieht sich wirklich spezifisch auf die kapillare Übertragung der RNS vom Elektrophorese-Gel bis die Beflecken-Membran. Jedoch wird der komplette Prozess das allgemein nördliche Beflecken genannt. Die nördliche Klecks-Technik wurde 1977 von James Alwine, David Kemp und George Stark an der Universität von Stanford entwickelt. Das nördliche Beflecken nimmt seinen Namen von seiner Ähnlichkeit bis die erste Beflecken-Technik, den Klecks von Southern, der für den Biologen Edwin Southern genannt ist. Der Hauptunterschied ist, dass RNS, aber nicht DNA, im nördlichen Klecks analysiert wird.

Verfahren

Ein allgemeines Beflecken-Verfahren fängt mit der Förderung der Gesamt-RNS von einer homogenisierten Gewebeprobe oder von Zellen an. Eukaryotic mRNA kann dann durch den Gebrauch von oligo (dT) Zellulose-Chromatographie isoliert werden, um nur jene RNAs mit einem poly (A) Schwanz zu isolieren. RNS-Proben werden dann durch die Gel-Elektrophorese getrennt. Da die Gele zerbrechlich sind und die Untersuchungen unfähig sind, in die Matrix einzugehen, werden die RNS-Proben, die jetzt durch die Größe getrennt sind, einer Nylonstrümpfe-Membran durch ein Haargefäß oder Vakuumbeflecken-System übertragen. Eine Nylonstrümpfe-Membran mit einer positiven Anklage ist für den Gebrauch im nördlichen Beflecken am wirksamsten, da die negativ beladenen Nukleinsäuren eine hohe Sympathie für sie haben. Der Übertragungspuffer, der für das Beflecken gewöhnlich verwendet ist, enthält formamide, weil es die Ausglühen-Temperatur der Wechselwirkung der Untersuchungs-RNS senkt, so RNS-Degradierung durch hohe Temperaturen verhindernd. Sobald die RNS der Membran übertragen worden ist, wird sie durch die covalent Verbindung zur Membran durch das UV Licht oder die Hitze unbeweglich gemacht. Nachdem eine Untersuchung etikettiert worden ist, wird sie zur RNS auf der Membran gekreuzt. Experimentelle Bedingungen, die die Leistungsfähigkeit und Genauigkeit der Kreuzung betreffen können, schließen Ionenstarke ein, Viskosität, Duplexlänge, hat Grundpaare und Grundzusammensetzung falsch angepasst. Die Membran wird gewaschen, um sicherzustellen, dass die Untersuchung spezifisch gebunden hat und Hintergrundsignale vom Entstehen zu vermeiden. Die hybriden Signale werden dann durch den Röntgenfilm entdeckt und können durch densitometry gemessen werden. Um Steuerungen zum Vergleich in einem nördlichen Klecks zu schaffen, können Proben, die nicht das Genprodukt von Interesse zeigen, nach dem Entschluss durch die Mikroreihe oder RT-PCR verwendet werden.

Gele

Die RNS-Proben werden meistens auf agarose Gelen getrennt, die formaldehyde als ein Denaturieren-Agent für die RNS enthalten, um sekundäre Struktur zu beschränken. Die Gele können mit dem ethidium Bromid (EtBr) und angesehen unter dem UV Licht befleckt sein, um die Qualität und Menge der RNS vor dem Beflecken zu beobachten. Gel von Polyacrylamide electrophoeresis mit dem Harnstoff kann auch in der RNS-Trennung verwendet werden, aber es wird meistens für die gebrochene RNS oder microRNAs verwendet. Eine RNS-Leiter wird häufig neben den Proben auf einem Elektrophorese-Gel geführt, um die Größe von erhaltenen Bruchstücken zu beobachten, aber in Gesamt-RNS-Proben können die ribosomal Subeinheiten als Größe-Anschreiber handeln. Da die große ribosomal Subeinheit 28 (etwa 5 Kilobytes) ist und die kleine ribosomal Subeinheit 18 (etwa 2 Kilobytes) ist, werden zwei prominente Bänder auf dem Gel, dem größeren an in der Nähe von zweimal der Intensität des kleineren erscheinen.

Untersuchungen

Untersuchungen für das nördliche Beflecken werden aus Nukleinsäuren mit einer Ergänzungsfolge zu allen oder einem Teil der RNS von Interesse zusammengesetzt, sie können DNA, RNS oder oligonucleotides mit einem Minimum von 25 Ergänzungsbasen zur Zielfolge sein. RNS-Untersuchungen (riboprobes), die in vitro abgeschrieben werden, sind im Stande, strengeren Waschschritten zu widerstehen, die etwas vom Nebengeräusch verhindern. Allgemein wird cDNA mit etikettierten Zündvorrichtungen für die RNS-Folge von Interesse geschaffen, um als die Untersuchung im nördlichen Klecks zu handeln. Die Untersuchungen müssen entweder mit radioaktiven Isotopen (P) oder mit der Chemilumineszenz in der alkalischer phosphatase oder Meerrettich peroxidase Depression chemiluminescent Substrate etikettiert werden, die eine feststellbare Emission des Lichtes erzeugen. Das Chemiluminescent-Beschriften kann auf zwei Weisen vorkommen: Entweder die Untersuchung wird dem Enzym beigefügt, oder die Untersuchung wird mit einem ligand etikettiert (z.B biotin), für den der Antikörper (z.B avidin oder streptavidin) dem Enzym beigefügt wird. Röntgenfilm kann sowohl das radioaktive als auch die Chemiluminescent-Signale entdecken, und viele Forscher bevorzugen die Chemiluminescent-Signale, weil sie schneller, empfindlicher sind, und die Gesundheitsrisikos reduzieren, die zusammen mit radioaktiven Etiketten gehen. Dieselbe Membran kann bis zu fünfmal ohne einen bedeutenden Verlust der Ziel-RNS untersucht werden.

Anwendungen

Das nördliche Beflecken erlaubt, ein Ausdruck-Muster eines besonderen Gens zwischen Geweben, Organen, Entwicklungsstufen, Umweltbelastungsniveaus, pathogen Infektion, und über den Kurs der Behandlung zu beobachten. Die Technik ist verwendet worden, um Überausdruck von oncogenes und downregulation von Genen des Geschwulst-Entstörgeräts in krebsbefallenen Zellen wenn im Vergleich zum 'normalen' Gewebe, sowie dem Genausdruck in der Verwerfung von umgepflanzten Organen zu zeigen. Wenn ein upregulated Gen durch einen Überfluss an mRNA auf dem nördlichen Klecks beobachtet wird, kann die Probe dann sequenced sein, um zu bestimmen, ob das Gen Forschern bekannt ist, oder wenn es eine neuartige Entdeckung ist. Die unter gegebenen Bedingungen erhaltenen Ausdruck-Muster können Einblick in die Funktion dieses Gens gewähren. Da die RNS zuerst durch die Größe getrennt wird, wenn nur ein Untersuchungstyp verwendete Abweichung im Niveau jedes Bandes auf der Membran ist, kann Einblick in die Größe des Produktes gewähren, alternative Verbindungsprodukte desselben Gens oder wiederholender Folge-Motive andeutend. Die Abweichung in der Größe eines Genproduktes kann auch Auswischen oder Fehler in der Abschrift-Verarbeitung, durch das Ändern des Untersuchungsziels anzeigen, das entlang der bekannten Folge verwendet ist, die es möglich ist zu bestimmen, welches Gebiet der RNS vermisst wird.

BlotBase ist eine Online-Datenbank, die nördliche Kleckse veröffentlicht. BlotBase hat mehr als 700 veröffentlichte nördliche Kleckse des Menschen und der Maus-Proben in mehr als 650 Genen über mehr als 25 verschiedene Gewebetypen. Nördliche Kleckse können durch einen Klecks-Personalausweis, Papierverweisung, Genbezeichner, oder durch das Gewebe gesucht werden. Die Ergebnisse einer Suche stellen den Klecks-Personalausweis, Arten, Gewebe, Gen, Ausdruck-Niveau zur Verfügung, beflecken Image (wenn verfügbar), und Verbindungen zur Veröffentlichung, aus der die Arbeit entstanden ist. Diese neue Datenbank stellt das Teilen der Information zwischen Mitgliedern der Wissenschaftsgemeinschaft zur Verfügung, die im nördlichen Beflecken nicht vorher gesehen wurde, wie es in der Folge-Analyse, dem Genom-Entschluss, der Protein-Struktur usw. war.

Vorteile und Nachteile

Die Analyse des Genausdrucks kann durch mehrere verschiedene Methoden einschließlich RT-PCR, RNase Schutzfeinproben, Mikroreihe, Serienanalyse des Genausdrucks (WEISER), sowie das nördliche Beflecken getan werden. Mikroreihe wird ganz allgemein verwendet und ist gewöhnlich mit bei nördlichen Klecksen erhaltenen Daten im Einklang stehend; jedoch zuweilen ist das nördliche Beflecken im Stande, kleine Änderungen im Genausdruck zu entdecken, der Mikroreihe nicht kann. Der Vorteil, den Mikroreihe über nördliche Kleckse hat, besteht darin, dass Tausende von Genen auf einmal vergegenwärtigt werden können, während das nördliche Beflecken gewöhnlich auf eines oder eine kleine Zahl von Genen schaut.

Ein Problem im nördlichen Beflecken ist häufig Beispieldegradierung durch RNases (sowohl endogen zur Probe als auch durch die Umweltverunreinigung), der durch die richtige Sterilisation des Glases und den Gebrauch von RNase Hemmstoffen wie DEPC (diethylpyrocarbonate) vermieden werden kann. Die in den meisten nördlichen Klecksen verwendeten Chemikalien können eine Gefahr dem Forscher, seitdem formaldehyde, radioaktives Material, ethidium Bromid, DEPC sein, und UV Licht ist alle unter bestimmten Aussetzungen schädlich. Im Vergleich zu RT-PCR hat das nördliche Beflecken eine niedrige Empfindlichkeit, aber es hat auch eine hohe Genauigkeit, die wichtig ist, falsche positive Ergebnisse zu reduzieren.

Die Vorteile, das nördliche Beflecken zu verwenden, schließen die Entdeckung der RNS-Größe ein, die Beobachtung von abwechselnden Verbindungsprodukten, der Gebrauch von Untersuchungen mit der teilweisen Homologie, der Qualität und Menge der RNS können auf dem Gel vor dem Beflecken gemessen werden, und die Membranen können versorgt und seit Jahren nach dem Beflecken wiederuntersucht werden.

Kehren Sie nördlichen Klecks um

Eine Variante des als der nördliche Rückklecks bekannten Verfahrens wird gelegentlich verwendet. In diesem Verfahren ist die Substrat-Nukleinsäure (der an der Membran angebracht wird) eine Sammlung von isolierten DNA-Bruchstücken, und die Untersuchung ist RNS, die aus einem Gewebe herausgezogen ist und radioaktiv etikettiert ist.

Der Gebrauch der DNA-Mikroreihe, die in weit verbreiteten Gebrauch gegen Ende der 1990er Jahre und Anfang der 2000er Jahre eingetreten ist, ist mit dem Rückverfahren verwandter, darin schließen sie den Gebrauch von isolierten DNA-Bruchstücken ein, die an einem Substrat und Kreuzung mit einer von der Zell-RNS gemachten Untersuchung angebracht sind. So hat das Rückverfahren, obwohl ursprünglich ungewöhnlich, nördlicher Analyse ermöglicht, sich zum Kopierfräs-Genausdruck zu entwickeln, in dem viele (vielleicht alle) der Gene in einem Organismus ihren Ausdruck kontrollieren lassen können.

Siehe auch

• Westklecks
• Das Weit-Ostbeflecken
• Das Weit-Westbeflecken
• Das Ostbeflecken
• Differenzialanzeige

Außenverbindungen

• OpenWetWare