Luciferase ist ein Oberbegriff für die Klasse von oxidative Enzymen, die in bioluminescence verwendet sind, und ist von einem Photoprotein verschieden. Ein berühmtes Beispiel ist der Leuchtkäfer luciferase vom Leuchtkäfer Photinus pyralis. "Leuchtkäfer luciferase" als ein Laborreagens bezieht sich gewöhnlich auf P. pyralis luciferase, obwohl recombinant luciferases von mehreren anderen Arten von Leuchtkäfern auch gewerblich verfügbar sind. Der Name wird aus Luzifer, der Wurzel dessen abgeleitet, was 'leichten Träger' (lucem ferre) bedeutet.

Chemische Reaktion

Die chemische Reaktion, die vom Leuchtkäfer luciferase katalysiert ist, findet in zwei Schritten statt:

• luciferin + ATP  luciferyl adenylate + SEITEN
• luciferyl adenylate + O  oxyluciferin + AMPERE + Licht

Licht wird ausgestrahlt, weil die Reaktion oxyluciferin in einem elektronisch aufgeregten Staat bildet. Die Reaktion veröffentlicht ein Foton des Lichtes, als oxyluciferin zum Boden-Staat zurückkehrt.

Luciferyl adenylate kann an einer Seitenreaktion mit O zusätzlich teilnehmen, um Wasserstoffperoxid und DEHYDROLUCIFERYL-AMPERE zu bilden. Ungefähr 20 % des luciferyl adenylate Zwischenglied werden in diesem Pfad oxidiert.

Die durch bakteriellen luciferase katalysierte Reaktion ist auch ein Oxidative-Prozess:

• FMNH + O + RCHO  FMN + RCOOH + HO + Licht

In der Reaktion oxidiert ein reduzierter flavin mononucleotide eine lange Kette aliphatic Aldehyd zu einem aliphatic carboxylic Säure. Die Reaktion bildet ein aufgeregtes hydroxyflavin Zwischenglied, das zum Produkt FMN dehydriert wird, um blau-grünes Licht auszustrahlen.

Fast der ganze Energieeingang in die Reaktion wird ins Licht umgestaltet. Die Reaktion ist um 80 % bis 90 % effizient. Als ein Vergleich wandelt die Glühglühbirne nur ungefähr 10 % seiner Energie ins Licht um. und 150 Lumen pro Watt (lm/W) haben Bekehrte 20 % der Eingangsenergie zum sichtbaren Licht GEFÜHRT.

Mechanismus

Leuchtkäfer luciferase erzeugt Licht von luciferin in einem Mehrschritt-Prozess. Erstens ist D-luciferin adenylated durch MgATP, um luciferyl adenylate und pyrophosphate zu bilden. Nach der Aktivierung durch ATP luciferyl wird adenylate durch molekularen Sauerstoff oxidiert, um einen Dioxetanone-Ring zu bilden. Eine Decarboxylierungsreaktion bildet einen aufgeregten Staat von oxyluciferin, den tautomerizes zwischen dem keto-enol bilden. Die Reaktion strahlt schließlich Licht aus, als oxyluciferin zum Boden-Staat zurückkehrt.

Luciferase Struktur

Die Protein-Struktur des Leuchtkäfers luciferase besteht aus zwei Kompaktgebieten: das N-Endgebiet und das C-Endgebiet. Das N-Endgebiet wird aus zwei β-sheets in  Struktur und ein β Barrel zusammengesetzt. Die zwei β-sheets schobern aufeinander mit dem β-barrel auf, der das Ende der Platten bedeckt.

Das C-Endgebiet wird mit dem N-Endgebiet durch ein flexibles Scharnier verbunden, das die zwei Gebiete trennen kann. Die Aminosäure-Folge auf der Oberfläche der zwei Gebiete, die einander ins Gesicht sehen, wird im bakteriellen und Leuchtkäfer luciferase erhalten, dadurch stark darauf hinweisend, dass die aktive Seite in der Spalte zwischen den Gebieten gelegen wird.

Während einer Reaktion hat luciferase eine Conformational-Änderung und tritt in eine "geschlossene" Form mit den zwei Gebieten ein, die zusammen kommen, um das Substrat einzuschließen. Das stellt sicher, dass Wasser von der Reaktion ausgeschlossen wird und nicht hydrolyze ATP oder das elektronisch aufgeregte Produkt tut.

Geisterhafte Unterschiede in bioluminescence

Farbe von Luciferase bioluminescence kann sich zwischen dem Gelbgrün (λ = 550 nm) zu rot (λ = 620) ändern. Es gibt zurzeit mehrere verschiedene Mechanismen, die beschreiben, wie die Struktur von luciferase das Emissionsspektrum des Fotons und effektiv der Farbe des ausgestrahlten Lichtes betrifft.

Ein Mechanismus schlägt vor, dass die Farbe des ausgestrahlten Lichtes abhängt, ob das Produkt im keto oder der Enol-Form ist. Der Mechanismus weist darauf hin, dass roter Licht von der Keto-Form von oxyluciferin ausgestrahlt wird, während grünes Licht von der Enol-Form von oxyluciferin ausgestrahlt wird. Jedoch, 5,5-dimethyloxyluciferin strahlt grünes Licht aus, wenn auch es zur Keto-Form eingezwängt wird, weil es nicht tautomerize kann.

Ein anderer Mechanismus schlägt vor, dass die Drehung des Winkels zwischen benzothiazole und Thiazole-Ringen in oxyluciferin die Farbe von bioluminescence bestimmt. Diese Erklärung schlägt vor, dass eine planare Form mit einem Winkel von 0 ° zwischen den zwei Ringen einer höheren Energie entspricht, setzen fest, und strahlt eine höhere Energie grünes Licht aus, wohingegen ein Winkel von 90 ° die Struktur in einer niedrigeren Energie stellt, setzen fest, und strahlt einen roten Licht der niedrigeren Energie aus.

Die neuste Erklärung für die Bioluminescence-Farbe untersucht die Mikroumgebung des aufgeregten oxyluciferin. Studien weisen darauf hin, dass die Wechselwirkungen zwischen dem aufgeregten Zustandprodukt und den nahe gelegenen Rückständen den oxyluciferin in eine noch höhere Energieform zwingen können, die auf die Emission des grünen Lichtes hinausläuft. Zum Beispiel hat Arg 218 elektrostatische Wechselwirkungen mit anderen nahe gelegenen Rückständen, oxyluciferin von tautomerizing bis die Enol-Form einschränkend. Ähnlich haben andere Ergebnisse angezeigt, dass die Mikroumgebung von luciferase oxyluciferin in eine starrere, energiereiche Struktur zwingen kann, es zwingend, ein energiereiches grünes Licht auszustrahlen.

Bifunctionality von luciferase

Luciferase kann in zwei verschiedenen Pfaden fungieren: ein bioluminescence Pfad und ein CoA-ligase Pfad. In beiden Pfaden, luciferase katalysiert am Anfang eine adenylation Reaktion mit MgATP. Jedoch, im CoA-ligase Pfad, kann CoA AMPERE versetzen, um luciferyl CoA zu bilden.

Fetthaltiger Acyl-CoA synthetase aktiviert ähnlich Fettsäuren mit ATP, der von der Versetzung des AMPERES mit CoA gefolgt ist. Wegen ihrer ähnlichen Tätigkeiten ist luciferase im Stande, fetthaltigen Acyl-CoA synthetase und Bekehrter-lange Kette Fettsäuren ins Fett-Acyl CoA für die Beta-Oxydation zu ersetzen.

Regulierung

D-luciferin ist das Substrat für die bioluminescence Reaktion von luciferase, während L-luciferin das Substrat für die Tätigkeit von Luciferyl-CoA synthetase ist. Beide Reaktionen werden durch den enantiomer des Substrats gehemmt: L-luciferin und D-luciferin hemmen den bioluminescence Pfad und den CoA-ligase Pfad beziehungsweise. Das zeigt, dass luciferase zwischen dem isomers der luciferin Struktur differenzieren kann.

L-luciferin ist im Stande, ein schwaches Licht auszustrahlen, wenn auch es ein Wettbewerbshemmstoff von D-luciferin und dem bioluminescence Pfad ist. Licht wird ausgestrahlt, weil der Synthese-Pfad von CoA zur bioluminescence Reaktion durch hydrolyzing das Endprodukt über einen esterase zurück zu D-luciferin umgewandelt werden kann.

Tätigkeit von Luciferase wird durch oxyluciferin und durch ATP aktivierten allosterically zusätzlich gehemmt. Wenn ATP zu den zwei allosteric Seiten des Enzyms, die Sympathie von luciferase bindet, ATP in seinen aktiven Seite-Zunahmen zu binden.

Beispiele

Eine Vielfalt von Organismen regelt ihre leichte Produktion mit verschiedenem luciferases in einer Vielfalt von Licht ausstrahlenden Reaktionen. Die berühmtesten sind die Leuchtkäfer, obwohl das Enzym in Organismen so verschieden besteht wie der Pilz von Jack-O-Lantern (Omphalotus olearius) und viele Seewesen. In Leuchtkäfern wird der erforderliche Sauerstoff durch eine Tube im Abdomen genannt die Unterleibsluftröhre geliefert. Der luciferases von Leuchtkäfern - von denen es mehr als 2000 Arten - und Elateroidea gibt (Leuchtkäfer, klicken Sie auf Käfer, und Verwandte) im Allgemeinen - sind verschieden genug, um in molekularem phylogeny nützlich zu sein. Der am meisten gründlich studierte luciferase ist der von Photinini Leuchtkäfer Photinus pyralis, der einen optimalen pH 7.8 hat.

Auch gut studiert ist der luciferase von Renilla reniformis. In diesem Organismus wird der luciferase (Renilla-luciferin 2-monooxygenase) mit einem luciferin-verbindlichen Protein sowie einem grünen Leuchtstoffprotein (GFP) nah vereinigt. Kalzium löst Ausgabe des luciferin (coelenterazine) vom luciferin verbindliches Protein aus. Das Substrat ist dann für die Oxydation durch den luciferase verfügbar, wo es zu coelenteramide mit einer resultierenden Ausgabe der Energie erniedrigt wird. Ohne GFP würde diese Energie als ein Foton des blauen Lichtes (Maximalemissionswellenlänge 482 nm) veröffentlicht. Jedoch, wegen des nah verbundenen GFP, wird die durch den luciferase veröffentlichte Energie stattdessen durch die Klangfülle-Energieübertragung auf den fluorophore des GFP verbunden, und wird nachher als ein Foton des grünen Lichtes (Maximalemissionswellenlänge 510 nm) veröffentlicht. Die katalysierte Reaktion ist:

• coelenterazine + O  coelenteramide + CO + Foton des Lichtes

Neuere luciferases sind kürzlich identifiziert worden, dass, verschieden von Renilla oder Firefly luciferase, natürlich verborgene Moleküle sind. Ein solches Beispiel ist Metridia luciferase (MetLuc), der aus copepod Seemetridia longa abgeleitet wird. Metridia longa hat abgesondert luciferase Gen verschlüsselt ein 24 kDa Protein, das ein N-Terminal sekretorisches Signal peptide 17 Aminosäure-Rückstände enthält. Die Empfindlichkeit und gibt hoch Zeichen, dass sich die Intensität dieses luciferase Moleküls vorteilhaft in vielen Reporter-Studien erweist. Einige der Vorteile, ein verborgenes Reporter-Molekül wie MetLuc zu verwenden, sind sein kein-lysis Protokoll, das erlaubt im Stande zu sein, lebende Zellfeinproben und vielfache Feinproben auf derselben Zelle zu führen.

Dinoflagellate luciferase

Dinoflagellate luciferase ist ein Mehrbereichsprotein, aus einem N-Endgebiet, und drei katalytischen Gebieten, jedem von denen vorangegangen durch ein spiralenförmiges Bündel-Gebiet bestehend.

Die Struktur des dinoflagellate luciferase katalytisches Gebiet ist gelöst worden. Der Kernteil des Gebiets ist ein 10 gestrandetes Beta-Barrel, das lipocalins und FABP strukturell ähnlich ist.

Das N-Endgebiet wird zwischen dinoflagellate luciferase und luciferin verbindliche Proteine (LBPs) erhalten. Es ist darauf hingewiesen worden, dass dieses Gebiet eine Wechselwirkung zwischen LBP und luciferase oder ihrer Vereinigung mit der vacuolar Membran vermitteln kann.

Das spiralenförmige Bündel-Gebiet hat eine drei Spirale-Bündel-Struktur, die vier wichtige histidines hält, die, wie man denkt, eine Rolle in der PH-Regulierung des Enzyms spielen.

Anwendungen

Luciferase kann im Laboratorium durch die Gentechnologie zu mehreren Zwecken erzeugt werden. Gene von Luciferase können synthetisiert und in Organismen oder transfected in Zellen eingefügt werden. Mäuse, Seidenraupen und Kartoffeln sind gerade einige Organismen, die bereits konstruiert worden sind, um das Protein zu erzeugen.

In der luciferase Reaktion wird Licht ausgestrahlt, wenn luciferase dem passenden luciferin Substrat folgt. Foton-Emission kann durch den leichten empfindlichen Apparat wie ein luminometer entdeckt werden oder hat optische Mikroskope modifiziert. Das erlaubt Beobachtung von biologischen Prozessen.

In der biologischen Forschung, luciferase wird allgemein als ein Reporter verwendet, um die transcriptional Tätigkeit mit Zellen zu bewerten, die transfected mit einer genetischen Konstruktion sind, die das luciferase Gen unter der Kontrolle eines Befürworters von Interesse enthält. Zusätzlich pro-lumineszierende Moleküle, die zu luciferin nach der Tätigkeit eines besonderen Enzyms umgewandelt werden, können verwendet werden, um Enzym-Tätigkeit in verbundenen oder Zweipunktluciferase-Feinproben zu entdecken. Solche Substrate sind verwendet worden, um caspase Tätigkeit und cytochrome P450 Tätigkeit, unter anderen zu entdecken.

Luciferase kann auch verwendet werden, um das Niveau von zellularem ATP in Zelllebensfähigkeitsfeinproben oder für kinase Tätigkeitsfeinproben zu entdecken. Luciferase kann als ein ATP Sensorprotein durch biotinylation handeln. Biotinylation wird luciferase auf der Zelloberfläche durch die Schwergängigkeit zu einem streptavidin-biotin Komplex unbeweglich machen. Das erlaubt luciferase, den efflux von ATP von der Zelle zu entdecken, und wird die Echtzeitausgabe von ATP durch bioluminescence effektiv zeigen. Luciferase kann empfindlicher für die ATP Entdeckung durch die Erhöhung der Lumineszenz-Intensität durch die genetische Modifizierung zusätzlich gemacht werden.

Ganze Tierbildaufbereitung (verwiesen auf als in vivo oder, gelegentlich, ab vivo, der darstellt), ist eine starke Technik, um Zellbevölkerungen in lebenden Tieren wie Mäuse zu studieren. Verschiedene Typen von Zellen (z.B Knochenmark-Stammzellen, T-Zellen) können konstruiert werden, um einen luciferase auszudrücken, das Erlauben ihrer nichtangreifenden Vergegenwärtigung innerhalb eines lebenden Tieres mit einer empfindlichen Gerät-Kamera des Anklage-Paares (CCD Kamera).This Technik ist verwendet worden, um tumorigenesis und Antwort von Geschwülsten zur Behandlung in Tiermodellen zu folgen. Jedoch können Umweltfaktoren und therapeutische Einmischungen einige Diskrepanzen zwischen Geschwulst-Last und bioluminescence Intensität in Bezug auf Änderungen in der proliferative Tätigkeit verursachen. Die Intensität des Signals, das durch in der Vivo-Bildaufbereitung gemessen ist, kann von verschiedenen Faktoren, wie D-Luciferin-Absorption durch das Bauchfell, den Blutfluss, die Zellmembranendurchdringbarkeit, die Verfügbarkeit von Co-Faktoren, intrazellulärem pH und Durchsichtigkeit abhängen, auf Gewebe zusätzlich zum Betrag von luciferase zu liegen.

Luciferase kann in Blutbanken verwendet werden, um zu bestimmen, ob rote Blutzellen anfangen zusammenzubrechen. Forensische Ermittlungsbeamte können eine verdünnte Lösung verwenden, die das Enzym enthält, um Spuren des Bluts aufzudecken, das auf Oberflächen an einem Tatort bleibt. Luciferase ist eine Hitze empfindliches Protein, das in Studien auf dem Protein denaturation verwendet wird, die Schutzkapazitäten von Hitzestoß-Proteinen prüfend. Die Gelegenheiten, um luciferase zu verwenden, setzen fort sich auszubreiten.

Siehe auch

• Leuchtkäfer
• Luciferin
• Quorum, das fühlt

Links