Ein Beschränkungsenzym (oder Beschränkung endonuclease) ist ein Enzym, das DNA bei der spezifischen Anerkennung nucleotide Folgen (mit Beschränkungsenzymen des Typs II schneidet, doppelt gestrandete DNA schneidend), bekannt als Beschränkungsseiten. Wie man denkt, haben sich solche Enzyme, die in Bakterien und archaea gefunden sind, entwickelt, um einen Abwehrmechanismus gegen das Eindringen in Viren zur Verfügung zu stellen. Innerhalb eines Bakteriengastgebers schneiden die Beschränkungsenzyme auswählend Auslands-DNA in einem Prozess genannt Beschränkung; Gastgeber-DNA ist methylated durch ein Modifizierungsenzym (ein methylase), um es vor der Beschränkungsenzym-Tätigkeit zu schützen. Insgesamt bilden diese zwei Prozesse das Beschränkungsmodifizierungssystem. Um die DNA zu schneiden, macht ein Beschränkungsenzym zwei Einschnitte, einmal durch jedes Zuckerphosphat-Rückgrat (d. h. jedes Ufer) der DNA doppelte Spirale.

Mehr als 3000 Beschränkungsenzyme sind im Detail studiert worden, und mehr als 600 von diesen sind gewerblich verfügbar und werden für die DNA-Modifizierung und Manipulation in Laboratorien alltäglich verwendet.

Geschichte

Für die erste Isolierung eines Beschränkungsenzyms, HindII, 1970, und der nachfolgenden Entdeckung und Charakterisierung der zahlreichen Beschränkung endonucleases, wurde der 1978-Nobelpreis für die Physiologie oder Medizin Daniel Nathans, Werner Arber und Hamilton O. Smith zuerkannt. Ihre Entdeckung hat zur Entwicklung der recombinant DNA-Technologie geführt, die, zum Beispiel, die in großem Umfang Produktion des menschlichen Insulins für Diabetiker erlaubt hat, die E. coli Bakterien verwenden.

Anerkennungsseite

Beschränkungsenzyme erkennen eine spezifische Folge von nucleotides an und erzeugen eine doppelt gestrandete Kürzung in der DNA. Während sich Anerkennungsfolgen zwischen 4 und 8 nucleotides ändern, sind viele von ihnen palindromic, die stickstoffhaltigen Grundfolgen entsprechen, die dasselbe umgekehrt und vorwärts lesen. In der Theorie gibt es zwei Typen von palindromic Folgen, die in der DNA möglich sein können. Das spiegelähnliche Palindrom ist denjenigen ähnlich, die im gewöhnlichen Text gefunden sind, in dem eine Folge dasselbe vorwärts und umgekehrt auf einem einzelnen Ufer des DNA-Ufers, als in GTAATG liest. Das umgekehrte mehrmalige Palindrom ist auch eine Folge, die dasselbe vorwärts und umgekehrt liest, aber der nachschicken und die rückwärts gerichteten Folgen werden in Ergänzungs-DNA-Ufern (d. h., der doppelt gestrandeten DNA), als in GTATAC (GTATAC gefunden ergänzend zu CATATG zu sein). Umgekehrte mehrmalige Palindrome sind üblicher und haben größere biologische Wichtigkeit als spiegelähnliche Palindrome.

Verzehren von EcoRI erzeugt "klebrige" Enden,

wohingegen Beschränkungsenzym-Spaltung von SmaI "stumpfe" Enden erzeugt:

Anerkennungsfolgen in der DNA unterscheiden sich für jedes Beschränkungsenzym, Unterschiede in der Länge erzeugend, Folge und Ufer-Orientierung (5' Ende oder das 3' Ende) eines klebrigen Endes "hängen" von einer Enzym-Beschränkung "über".

Verschiedene Beschränkungsenzyme, die dieselbe Folge anerkennen, sind als neoschizomers bekannt. Diese kleben häufig in verschiedenen Schauplätzen der Folge. Verschiedene Enzyme, die anerkennen und in derselben Position kleben, sind als isoschizomers bekannt.

Typen

Natürlich vorkommende Beschränkung endonucleases wird in vier Gruppen (Typen I, II III, und IV) gestützt auf ihrer Zusammensetzung und Enzym cofactor Voraussetzungen, die Natur ihrer Zielfolge und die Position ihrer DNA-Spaltungsseite hinsichtlich der Zielfolge kategorisiert. Alle Typen von Enzymen erkennen spezifische kurze DNA-Folgen und führen die endonucleolytic Spaltung der DNA aus, um spezifische Bruchstücke mit '-Phosphaten des Terminals 5 zu geben. Sie unterscheiden sich in ihrer Anerkennungsfolge, Subeinheitszusammensetzung, Spaltungsposition und cofactor Voraussetzungen, wie zusammengefasst, unten:

• Enzyme des Typs I kleben an von der Anerkennungsseite entfernten Seiten; verlangen Sie, dass sowohl ATP als auch S adenosyl L methionine fungiert; mehrfunktionelles Protein sowohl mit der Beschränkung als auch mit methylase Tätigkeiten.
• Enzyme des Typs II kleben innerhalb oder in kurzen spezifischen Entfernungen von der Anerkennungsseite; die meisten verlangen Magnesium; einzelne Funktion (Beschränkung) von methylase unabhängige Enzyme.
• Enzyme des Typs III zerspalten an Seiten eine kurze Entfernung von der Anerkennungsseite; verlangen Sie ATP (aber tut nicht hydrolyse es); S adenosyl L stimuliert methionine Reaktion, aber ist nicht erforderlich; bestehen Sie als ein Teil eines Komplexes mit einer Modifizierung methylase .
• Enzyme des Typs IV nehmen normale DNA ins Visier.

Typ I

Beschränkungsenzyme des Typs I waren erst, um identifiziert zu werden, und wurden zuerst in zwei verschiedenen Beanspruchungen (K-12 und B) von E. coli identifiziert. Diese Enzym-Kürzung an einer Seite, die sich unterscheidet, und eine zufällige Entfernung (mindestens 1000 bp) weg von ihrer Anerkennungsseite ist. Die Spaltung an diesen zufälligen Seiten folgt einem Prozess der DNA-Versetzung, die zeigt, dass diese Enzyme auch molekulare Motoren sind. Die Anerkennungsseite ist asymmetrisch und wird aus zwei spezifischen Teilen — einem zusammengesetzt, 3-4 nucleotides und anderen enthaltend, 4-5 nucleotides — getrennt durch eine nichtspezifische Distanzscheibe von ungefähr 6-8 nucleotides enthaltend. Diese Enzyme sind mehrfunktionell und sind sowohl zur Beschränkung als auch zu den Modifizierungstätigkeiten abhängig von methylation Status der Ziel-DNA fähig. Cofactors S-Adenosyl methionine (AdoMet), hydrolyzed Adenosin triphosphate (ATP) und Magnesium (Mg) Ionen, sind für ihre volle Tätigkeit erforderlich. Beschränkungsenzyme des Typs I besitzen drei Subeinheiten genannt HsdR, HsdM und HsdS; HsdR ist für die Beschränkung erforderlich; HsdM ist notwendig, um Methyl-Gruppen hinzuzufügen, um DNA zu veranstalten (methyltransferase Tätigkeit), und HsdS ist für die Genauigkeit der Anerkennung (DNA-SCHWERGÄNGIGKEIT) Seite zusätzlich zu beider Beschränkung (DNA-Spaltung) und Modifizierung (DNA methyltransferase) Tätigkeit wichtig.

Typ II

Typische Beschränkungsenzyme des Typs II unterscheiden sich von Beschränkungsenzymen des Typs I auf mehrere Weisen. Sie sind ein dimer von nur einem Typ der Subeinheit; ihre Anerkennungsseiten sind gewöhnlich ungeteilt und palindromic und 4-8 nucleotides in der Länge, sie erkennen an und zerspalten DNA an derselben Seite, und sie verwenden ATP oder AdoMet für ihre Tätigkeit nicht — sie verlangen gewöhnlich nur Mg als ein cofactor. Das sind die meistens verfügbaren und verwendeten Beschränkungsenzyme. In den 1990er Jahren und Anfang der 2000er Jahre wurden neue Enzyme von dieser Familie entdeckt, der allen klassischen Kriterien dieser Enzym-Klasse nicht gefolgt ist, und neue Unterfamilie-Nomenklatur entwickelt wurde, um diese große Familie in Unterkategorien zu teilen, die auf Abweichungen von typischen Eigenschaften von Enzymen des Typs II gestützt sind. Diese Untergruppen werden mit einer Brief-Nachsilbe definiert.

Typ IIB Beschränkungsenzyme (z.B. BcgI und BplI) sind multimers, mehr als eine Subeinheit enthaltend. Sie zerspalten DNA an beiden Seiten ihrer Anerkennung, um die Anerkennungsseite auszuschneiden. Sie verlangen sowohl AdoMet als auch Mg cofactors. Typ IIE Beschränkung endonucleases (z.B. NaeI) zerspalten DNA im Anschluss an die Wechselwirkung mit zwei Kopien ihrer Anerkennungsfolge. Anerkennungsseite-Taten als das Ziel für die Spaltung, während die anderen Taten als ein allosteric Effektor, der beschleunigt oder die Leistungsfähigkeit der Enzym-Spaltung verbessert. Ähnlich Enzymen des Typs IIE, Beschränkung des Typs IIF endonucleases (z.B. NgoMIV) wirken mit zwei Kopien ihrer Anerkennungsfolge aufeinander, aber zerspalten beide Folgen zur gleichen Zeit. Typ IIG Beschränkung endonucleases (Eco57I) hat wirklich eine einzelne Subeinheit wie klassische Beschränkungsenzyme des Typs II, aber verlangt, dass cofactor AdoMet aktiv ist. Typ IIM Beschränkung endonucleases, wie DpnI, ist im Stande, methylated DNA anzuerkennen und zu schneiden. Typ IIS Beschränkung endonucleases (z.B. FokI) zerspalten DNA in einer definierten Entfernung von ihren non-palindromic asymmetrischen Anerkennungsseiten. Diese Enzyme können als dimers fungieren. Ähnlich wird Typ IIT Beschränkungsenzyme (z.B, Bpu10I und BslI) aus zwei verschiedenen Subeinheiten zusammengesetzt. Einige erkennen palindromic Folgen an, während andere asymmetrische Anerkennungsseiten haben.

Typ III

Beschränkungsenzyme des Typs III (z.B. EcoP15) erkennen zwei getrennte non-palindromic Folgen an, die umgekehrt orientiert werden. Sie schneiden DNA ungefähr 20-30 Grundpaare nach der Anerkennungsseite. Diese Enzyme enthalten mehr als eine Subeinheit und verlangen AdoMet und ATP cofactors für ihre Rollen in der DNA methylation und Beschränkung beziehungsweise. Sie sind Bestandteile von prokaryotic DNA-Beschränkungsmodifizierungsmechanismen, die den Organismus gegen das Eindringen in Auslands-DNA schützen. Enzyme des Typs III sind Hetero-oligomeric, mehrfunktionelle Proteine, die aus zwei Subeinheiten, Res und Mod zusammengesetzt sind. Die Mod Subeinheit erkennt die DNA-Folge, die für das System spezifisch ist, und ist eine Modifizierung methyltransferase; als solcher ist es zur M und den S Subeinheiten der Beschränkung des Typs I endonuclease funktionell gleichwertig. Res ist für die Beschränkung erforderlich, obwohl es keine enzymatische Tätigkeit selbstständig hat. Enzyme des Typs III erkennen kurze 5-6 bp lange asymmetrische DNA-Folgen und zerspalten 25-27 bp stromabwärts, um kurz zu verlassen, einzeln - hat 5' Vorsprünge stranden lassen. Sie verlangen, dass die Anwesenheit von zwei umgekehrt unmethylated Anerkennungsseiten für die Beschränkung orientiert hat vorzukommen. Diese Enzyme methylate nur ein Ufer der DNA, an der n-6 Position von adenosyl Rückständen, haben so kürzlich DNA wiederholt wird nur ein Ufer methylated haben, der genügend ist, um gegen die Beschränkung zu schützen. Enzyme des Typs III gehören der Beta-Unterfamilie des N6 Adenin methyltransferases, die neun Motive enthaltend, die diese Familie, einschließlich des Motivs I, AdoMet verbindliche Tasche (FXGXG) und Motiv IV, das katalytische Gebiet (S/D/N (SEITEN) Y/F) charakterisieren.

Künstliche Beschränkungsenzyme

Künstliche Beschränkungsenzyme können durch das Schmelzen einer natürlichen oder konstruierten DNA verbindliches Gebiet zu einem nuclease Gebiet (häufig das Spaltungsgebiet des Beschränkungsenzyms des Typs IIS FokI) erzeugt werden. Solche künstlichen Beschränkungsenzyme können große DNA-Seiten (bis zu 36 bp) ins Visier nehmen und können konstruiert werden, um zu gewünschten DNA-Folgen zu binden. Zinkfinger nucleases ist die meistens verwendeten künstlichen Beschränkungsenzyme und wird allgemein in Gentechnologie-Anwendungen verwendet, aber kann auch für mehr normale Genklonen-Anwendungen verwendet werden. Andere künstliche Beschränkungsenzyme basieren auf der DNA verbindliches Gebiet von TAL Effektoren.

Nomenklatur

Seit ihrer Entdeckung in den 1970er Jahren sind mehr als 100 verschiedene Beschränkungsenzyme in verschiedenen Bakterien identifiziert worden. Jedes Enzym wird nach der Bakterie genannt, von der es mit einem Namengeben-System isoliert wurde, das auf der Bakterienklasse, den Arten und der Beanspruchung gestützt ist. Zum Beispiel wurde der Name des Beschränkungsenzyms von EcoRI, wie gezeigt, im Kasten abgeleitet.

Anwendungen

:See der Hauptartikel über Beschränkungsauswahlen.

Isolierte Beschränkungsenzyme werden verwendet, um DNA für verschiedene wissenschaftliche Anwendungen zu manipulieren.

Sie werden verwendet, um Einfügung von Genen in plasmid Vektoren während des Genklonens und der Protein-Ausdruck-Experimente zu helfen. Für den optimalen Gebrauch, plasmids, die für das Genklonen allgemein verwendet werden, werden modifiziert, um eine kurze polylinker Folge einzuschließen (hat die vielfache Klonen-Seite oder MCS genannt) reich an Beschränkungsenzym-Anerkennungsfolgen. Das erlaubt Flexibilität, wenn es Genbruchstücke in den plasmid Vektoren einfügt; Beschränkungsseiten enthalten natürlich innerhalb von Genen beeinflussen die Wahl von endonuclease, für die DNA zu verdauen, da es notwendig ist, Beschränkung der gewollten DNA zu vermeiden, während man die Enden der DNA absichtlich schneidet. Um ein Genbruchstück in einen Vektoren zu klonen, werden sowohl plasmid DNA als auch Geneinsatz normalerweise mit denselben Beschränkungsenzymen geschnitten, und dann zusammen mit dem Beistand von einem Enzym geklebt, das als eine DNA ligase bekannt ist.

Beschränkungsenzyme können auch verwendet werden, um Genallele zu unterscheiden, indem sie einzelne Grundänderungen in der DNA bekannt als einzelner nucleotide polymorphisms (SNPs) spezifisch anerkannt wird. Das ist nur möglich, wenn ein SNP die Beschränkungsseite-Gegenwart im Allel verändert. In dieser Methode kann das Beschränkungsenzym an den Genotypen eine DNA-Probe ohne das Bedürfnis nach dem teuren Gen sequencing gewöhnt sein. Die Probe wird zuerst mit dem Beschränkungsenzym verdaut, um DNA-Bruchstücke, und dann die verschiedenen großen durch die Gel-Elektrophorese getrennten Bruchstücke zu erzeugen. Im Allgemeinen werden Allele mit richtigen Beschränkungsseiten zwei sichtbare Bänder der DNA auf dem Gel erzeugen, und diejenigen mit veränderten Beschränkungsseiten werden nicht geschnitten und werden nur ein einzelne Band erzeugen. Die Zahl von Bändern offenbart den Genotypen des Beispielthemas, ein Beispiel der kartografisch darstellenden Beschränkung.

Auf eine ähnliche Weise werden Beschränkungsenzyme verwendet, um genomic DNA für die Genanalyse durch den Südlichen Klecks zu verdauen. Diese Technik erlaubt Forschern sich zu identifizieren, wie viele Kopien (oder paralogues) eines Gens im Genom einer Person da sind, oder wie viele Genveränderungen (polymorphisms) innerhalb einer Bevölkerung vorgekommen sind. Das letzte Beispiel wird Beschränkungsbruchstück-Länge polymorphism (RFLP) genannt.

Beispiele

:See der Hauptartikel über die Liste von Beschränkungsenzym-Ausschnitt-Seiten.

Beispiele von Beschränkungsenzymen schließen ein:

Schlüssel:

= stumpfen Sie Enden ab

N = C oder G oder T oder ein

W = A oder T

Siehe auch

• Ausführliche Artikel über bestimmte Beschränkungsenzyme: EcoRI, HindIII, BglII.
• Liste von Beschränkungsenzym-Ausschnitt-Seiten
• Homing endonuclease
• Liste von homing endonuclease Ausschnitt von Seiten
• Isoschizomer.
• Sterntätigkeit
• Molekulargewicht-Größe-Anschreiber

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