Ein Klecks von Southern ist eine Methode, die alltäglich in der molekularen Biologie für die Entdeckung einer spezifischen DNA-Folge in DNA-Proben verwendet ist. Southern, der Vereinigungsübertragung von Elektrophorese-getrennten DNA-Bruchstücken zu einem Filter nachfolgende und Membranenbruchstück-Entdeckung durch die Untersuchungskreuzung befleckt. Die Methode wird nach seinem Erfinder, dem britischen Biologen Edwin Southern genannt. Andere Beflecken-Methoden (d. h., Westklecks, Nördlicher Klecks, Ostklecks, Südwestlicher Klecks), die ähnliche Grundsätze verwenden, aber Verwenden-RNS oder Protein, sind später in der Verweisung auf den Namen von Edwin Southern genannt worden. Wie die Technik namensgebend genannt wurde, wird Klecks von Southern kapitalisiert, wie für Eigennamen herkömmlich ist. Die Namen für andere Beflecken-Methoden können dieser Tagung analog folgen.

Methode

1. Beschränkung endonucleases wird verwendet, um DNA-Ufer des hohen Molekulargewichtes in kleinere Bruchstücke zu schneiden.
2. Die DNA-Bruchstücke sind dann electrophoresed auf einem agarose Gel, um sie durch die Größe zu trennen.
3. Wenn einige der DNA-Bruchstücke größer sind als 15 Kilobytes, dann vor dem Beflecken kann das Gel mit einer Säure, wie verdünnter HCl, der depurinates die DNA-Bruchstücke behandelt werden, die DNA in kleinere Stücke brechend, so effizientere Übertragung vom Gel bis Membran erlaubend.
4. Wenn alkalische Übertragungsmethoden verwendet werden, wird das DNA-Gel in eine Lauge gelegt (normalerweise Natriumshydroxyd enthaltend), um die doppelt gestrandete DNA zu denaturieren. Der denaturation in einer alkalischen Umgebung kann Schwergängigkeit der negativ beladenen DNA zu einer positiv beladenen Membran verbessern, es in einzelne DNA-Ufer für die spätere Kreuzung zur Untersuchung (sieh unten) trennend, und zerstört jede restliche RNS, die noch in der DNA da sein kann. Die Wahl von alkalischen über neutrale Übertragungsmethoden ist häufig jedoch empirisch und kann auf gleichwertige Ergebnisse hinauslaufen.
5. Eine Platte von nitrocellulose (oder, wechselweise, Nylonstrümpfe) Membran wird oben auf (oder unten, abhängig von der Richtung der Übertragung) das Gel gelegt. Druck wird gleichmäßig auf das Gel (entweder Verwenden-Ansaugen, oder durch das Stellen eines Stapels von Küchenrollen und einem Gewicht oben auf der Membran und dem Gel) angewandt, um gut zu sichern und sogar sich zwischen Gel und Membran in Verbindung zu setzen. Wenn man durch das Ansaugen 20X überwechselt, wird SSC Puffer verwendet, um ein Siegel zu sichern und zu verhindern, des Gels zu trocknen. Die Pufferübertragung durch die kapillare Handlung von einem Gebiet des Hochwasser-Potenzials zu einem Gebiet des niedrigen Wasserpotenzials (gewöhnlich Filterpapier und Papiertaschentücher) wird dann verwendet, um die DNA vom Gel auf der Membran zu bewegen; Ion-Austauschwechselwirkungen binden die DNA zur Membran wegen der negativen Anklage der DNA und positiven Anklage der Membran.
6. Die Membran wird dann in einem regelmäßigen oder Vakuumofen an 80 °C seit 2 Stunden gebacken (Standardbedingungen; nitrocellulose oder Nylonstrümpfe-Membran) oder ausgestellt zur Ultraviolettstrahlung (Nylonstrümpfe-Membran), um die übertragene DNA der Membran dauerhaft beizufügen.
7. Die Membran wird dann zu einer Kreuzungsuntersuchung — ein einzelnes DNA-Bruchstück mit einer spezifischen Folge ausgestellt, deren Anwesenheit in der Ziel-DNA bestimmt werden soll. Die Untersuchungs-DNA wird etikettiert, so dass sie, gewöhnlich durch das Verbinden der Radioaktivität oder das Markieren des Moleküls mit einem Leuchtstoff- oder Chromogenic-Färbemittel entdeckt werden kann. In einigen Fällen kann die Kreuzungsuntersuchung von der RNS, aber nicht DNA gemacht werden. Um die Genauigkeit der Schwergängigkeit der Untersuchung zur Beispiel-DNA zu sichern, verwenden allgemeinste Kreuzungsmethoden Lachs- oder Hering-Sperma-DNA, um der Membranenoberfläche zu blockieren, und nehmen DNA, deionized formamide, und Reinigungsmittel wie SDS ins Visier, um nichtspezifische Schwergängigkeit der Untersuchung zu reduzieren.
8. Nach der Kreuzung wird Überuntersuchung von der Membran gewaschen (normalerweise SSC Puffer verwendend), und das Muster der Kreuzung wird auf dem Röntgenfilm durch die Autoröntgenografie im Fall von einer radioaktiven oder Leuchtstoffuntersuchung, oder durch die Entwicklung der Farbe auf der Membran vergegenwärtigt, wenn eine chromogenic Entdeckungsmethode verwendet wird.

Ergebnis

Die Kreuzung der Untersuchung zu einem spezifischen DNA-Bruchstück auf der Filtermembran zeigt an, dass dieses Bruchstück DNA-Folge enthält, die zur Untersuchung ergänzend ist.

Der Übertragungsschritt der DNA vom Elektrophorese-Gel bis eine Membran erlaubt leichte Schwergängigkeit der etikettierten Kreuzungsuntersuchung zur Größe-fraktionierten DNA. Es berücksichtigt auch das Fixieren der Zieluntersuchungshybriden, die für die Analyse durch die Autoröntgenografie oder anderen Entdeckungsmethoden erforderlich sind.

Südliche Kleckse, die mit der Beschränkung Enzym-verdaute genomic DNA durchgeführt sind, können verwendet werden, um die Zahl von Folgen (z.B, Genkopien) in einem Genom zu bestimmen. Eine Untersuchung, die nur zu einem einzelnen DNA-Segment kreuzt, das durch das Beschränkungsenzym nicht geschnitten worden ist, wird ein einzelnes Band auf einem Südlichen Klecks erzeugen, wohingegen vielfache Bänder wahrscheinlich beobachtet werden, wenn die Untersuchung zu mehreren hoch ähnlichen Folgen kreuzt (z.B, diejenigen, die das Ergebnis der Folge-Verdoppelung sein können). Die Modifizierung der Kreuzungsbedingungen (zum Beispiel, die Kreuzungstemperatur vergrößernd oder Salz-Konzentration vermindernd), kann verwendet werden, um Genauigkeit und Abnahme-Kreuzung der Untersuchung zu Folgen zu vergrößern, die um weniger als 100 % ähnlich sind.

Siehe auch

• Beschränkungsbruchstück
• Genetischer Fingerabdruck

Links

• OpenWetWare