Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine wissenschaftliche Technik in der molekularen Biologie, um eine Single oder einige Kopien eines Stückes der DNA über mehrere Größenordnungen zu verstärken, Tausende zu Millionen von Kopien einer besonderen DNA-Folge erzeugend.

Entwickelt 1983 von Kary Mullis ist PCR jetzt ein allgemeiner und häufig unentbehrliche Technik, die in medizinischen und biologischen Forschungslaboratorien für eine Vielfalt von Anwendungen verwendet ist. Diese schließen DNA-Klonen für sequencing, DNA-BASIERTEN phylogeny oder Funktionsanalyse von Genen ein; die Diagnose von Erbkrankheiten; die Identifizierung von genetischen Fingerabdrücken (verwendet in Gerichtsmedizinen und Vaterschaft-Prüfung); und die Entdeckung und Diagnose von ansteckenden Krankheiten. 1993 wurde Mullis dem Nobelpreis in der Chemie zusammen mit Michael Smith für seine Arbeit an PCR zuerkannt.

Die Methode verlässt sich auf das Thermalradfahren, aus Zyklen der wiederholten Heizung und des Abkühlens der Reaktion für das DNA-Schmelzen und die enzymatische Erwiderung der DNA bestehend. Zündvorrichtungen (kurze DNA-Bruchstücke), Folgen enthaltend, die zum Zielgebiet zusammen mit einer DNA polymerase ergänzend sind (nach dem die Methode genannt wird), sind Schlüsselbestandteile, um auswählende und wiederholte Erweiterung zu ermöglichen. Als PCR Fortschritte wird die erzeugte DNA selbst als eine Schablone für die Erwiderung verwendet, eine Kettenreaktion in Gang setzend, in der die DNA-Schablone exponential verstärkt wird. PCR kann umfassend modifiziert werden, um eine breite Reihe von genetischen Manipulationen durchzuführen.

Fast alle PCR Anwendungen verwenden eine hitzestabile DNA polymerase, wie Taq polymerase, ein von der Bakterie Thermus aquaticus ursprünglich isoliertes Enzym. Diese DNA polymerase sammelt enzymatisch ein neues DNA-Ufer von DNA-Bausteinen, dem nucleotides, durch das Verwenden der einzeln gestrandeten DNA als eine Schablone und DNA oligonucleotides (auch genannt DNA-Zündvorrichtungen), die für die Einleitung der DNA-Synthese erforderlich sind. Die große Mehrheit von PCR Methoden verwendet das Thermalradfahren, d. h., abwechselnd Heizung und das Abkühlen der PCR Probe zu einer definierten Reihe von Temperaturschritten. Diese Rad fahrenden Thermalschritte sind zuerst für den physisch getrennten die zwei Ufer in einer DNA doppelte Spirale bei einer hohen Temperatur in einem Prozess genannt das DNA-Schmelzen notwendig. Bei einer niedrigeren Temperatur wird jedes Ufer dann als die Schablone in der DNA-Synthese durch die DNA polymerase verwendet, um die Ziel-DNA auswählend zu verstärken. Die Selektivität von PCR ergibt sich aus dem Gebrauch von Zündvorrichtungen, die zum DNA-Gebiet ergänzend sind, das für die Erweiterung unter spezifischen Rad fahrenden Thermalbedingungen ins Visier genommen ist.

PCR Grundsätze und Verfahren

PCR wird verwendet, um ein spezifisches Gebiet eines DNA-Ufers (das DNA-Ziel) zu verstärken. Die meisten PCR Methoden verstärken normalerweise DNA-Bruchstücke von bis zu ~10 Kilos Grundpaaren (Kilobyte), obwohl einige Techniken Erweiterung von Bruchstücken bis zu 40 Kilobytes in der Größe berücksichtigen.

Ein grundlegender aufgestellter PCR verlangt mehrere Bestandteile und Reagenzien. Diese Bestandteile schließen ein:

• DNA-Schablone, die das DNA-Gebiet zu verstärkendes (Ziel) enthält.
• Zwei Zündvorrichtungen, die zu den 3' (drei erste) Enden von jedem des Sinn- und Antisinnufers des DNA-Ziels ergänzend sind.
• Taq polymerase oder eine andere DNA polymerase mit einem Temperaturoptimum um 70 °C.
• Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs; nucleotides, der triphosphate Gruppen enthält), die Bausteine, von denen die DNA polymerase ein neues DNA-Ufer synthetisiert.
• Pufferlösung, eine passende chemische Umgebung für die optimale Tätigkeit und Stabilität der DNA polymerase zur Verfügung stellend.
• Divalent cations, Magnesium oder Mangan-Ionen; allgemein wird Mg verwendet, aber Mn kann für die PCR-vermittelte DNA mutagenesis verwertet werden, weil höhere Konzentration von Mn die Fehlerrate während der DNA-Synthese vergrößert
• Kalium-Ionen von Monovalent cation.

Der PCR wird in einem Reaktionsvolumen von 10-200 μl in kleinen Reaktionstuben (0.2-0.5 ml Volumina) in einem thermischen cycler allgemein ausgeführt. Der thermische cycler heizt und kühlt die Reaktionstuben ab, um die Temperaturen zu erreichen, die an jedem Schritt der Reaktion (sieh unten) erforderlich sind. Viele moderne thermische cyclers machen von der Wirkung von Peltier Gebrauch, die sowohl Heizung als auch das Abkühlen des Blocks erlaubt, der die PCR Tuben einfach durch das Umkehren des elektrischen Stroms hält. Dünn ummauerte Reaktionstuben erlauben günstigem Thermalleitvermögen, schnelle Thermaläquilibrierung zu berücksichtigen. Die meisten thermischen cyclers haben Deckel geheizt, um Kondensation an der Oberseite von der Reaktionstube zu verhindern. Ältere thermocyclers das Ermangeln an einem erhitzten Deckel verlangen eine Schicht von Öl oben auf der Reaktionsmischung oder einem Ball von Wachs innerhalb der Tube.

Verfahren

Gewöhnlich besteht PCR aus einer Reihe von 20-40 wiederholten Temperaturänderungen, genannt Zyklen mit jedem Zyklus, der allgemein aus 2-3 getrennten Temperaturschritten, gewöhnlich drei (Abb. 2) besteht. Dem Radfahren wird häufig durch einen einzelnen Temperaturschritt vorangegangen (genannt halten) bei einer hohen Temperatur (> 90°C), und gefolgt von hält man am Ende für die Endprodukt-Erweiterung oder kurze Lagerung. Die Temperaturen verwendet und die Zeitdauer sie werden in jedem Zyklus angewandt, hängen von einer Vielfalt von Rahmen ab. Diese schließen das Enzym ein, das für die DNA-Synthese, die Konzentration von divalent Ionen und dNTPs in der Reaktion und der schmelzenden Temperatur (Tm) der Zündvorrichtungen verwendet ist.

• Initialisierungsschritt: Dieser Schritt besteht daraus, die Reaktion zu einer Temperatur von 94-96 °C zu heizen (oder 98 °C, wenn äußerst thermostable polymerases verwendet werden), der seit 1-9 Minuten gehalten wird. Es ist nur für die DNA polymerases erforderlich, die Hitzeaktivierung durch den heißen Anfang PCR verlangen.
• Schritt von Denaturation: Dieser Schritt ist das erste regelmäßige Rad fahrende Ereignis und besteht daraus, die Reaktion zu 94-98 °C seit 20-30 Sekunden zu heizen. Es verursacht das DNA-Schmelzen der DNA-Schablone durch die Unterbrechung der Wasserstoffobligationen zwischen Ergänzungsbasen, das Nachgeben von einzeln gestrandeten DNA-Molekülen.
• Das Ausglühen des Schritts: Die Reaktionstemperatur wird zu 50-65 °C seit 20-40 Sekunden gesenkt, das Ausglühen der Zündvorrichtungen zur einzeln gestrandeten DNA-Schablone erlaubend. Normalerweise ist die Ausglühen-Temperatur um ungefähr 3-5 Grad Celsius unter Tm der verwendeten Zündvorrichtungen. Stabile Wasserstoffobligationen der DNA-DNA werden nur gebildet, wenn die Zündvorrichtungsfolge sehr nah die Schablone-Folge vergleicht. Der polymerase bindet zur Zündvorrichtungsschablone-Hybride und beginnt DNA-Synthese.
• Schritt der Erweiterung/Verlängerung: Die Temperatur an diesem Schritt hängt von der DNA polymerase verwendet ab; Taq polymerase hat seine optimale Tätigkeitstemperatur an 75-80 °C, und allgemein wird eine Temperatur von 72 °C mit diesem Enzym verwendet. An diesem Schritt synthetisiert die DNA polymerase ein neues zum DNA-Schablone-Ufer ergänzendes DNA-Ufer durch das Hinzufügen dNTPs, die zur Schablone in 5' zu 3' Richtung ergänzend sind, die 5 '-Phosphatgruppe des dNTPs mit der 3 '-hydroxyl Gruppe am Ende des werdenden (sich ausstreckenden) DNA-Ufers kondensierend. Die Erweiterungszeit hängt sowohl von der DNA polymerase verwendet als auch von der Länge des zu verstärkenden DNA-Bruchstücks ab. Als Faustregel, bei seiner optimalen Temperatur, wird die DNA polymerase polymerize eintausend Basen pro Minute. Unter optimalen Bedingungen, d. h. Wenn es keine Beschränkungen wegen des Begrenzens von Substraten oder Reagenzien an jedem Erweiterungsschritt gibt, wird der Betrag des DNA-Ziels verdoppelt, (zu geometrischer) Exponentialerweiterung des spezifischen DNA-Bruchstücks führend.
• Endverlängerung: Dieser Einzelschritt wird gelegentlich bei einer Temperatur von 70-74 °C seit 5-15 Minuten nach dem letzten PCR Zyklus durchgeführt, um sicherzustellen, dass jede restliche einzeln gestrandete DNA völlig erweitert wird.
• Endgültig halten Sie: Dieser Schritt an 4-15 °C seit einer unbestimmten Zeit kann für die Kurzzeitlagerung der Reaktion verwendet werden.

Zu überprüfen, ob der PCR das vorausgesehene DNA-Bruchstück (auch manchmal gekennzeichnet als der amplimer oder amplicon), agarose Gel-Elektrophorese erzeugt hat, wird für die Größe-Trennung der PCR Produkte verwendet. Die Größe (N) von PCR Produkten wird vergleichsweise mit einer DNA-Leiter bestimmt (ein Molekulargewicht-Anschreiber), der DNA-Bruchstücke der bekannten Größe enthält, die auf dem Gel neben den PCR Produkten geführt ist (sieh Abb. 3).

PCR Stufen

Der PCR-Prozess kann in drei Stufen geteilt werden:

Exponentialerweiterung: An jedem Zyklus wird der Betrag des Produktes (das Annehmen der 100-%-Reaktionsleistungsfähigkeit) verdoppelt. Die Reaktion ist sehr empfindlich: Nur Minutenmengen der DNA müssen da sein.

Bühne abfangend: Die Reaktion verlangsamt sich, weil die DNA polymerase Tätigkeit verliert, und weil der Verbrauch von Reagenzien wie dNTPs und Zündvorrichtungen sie veranlasst, das Begrenzen zu werden.

Plateau: Kein Produkt mehr wächst wegen der Erschöpfung von Reagenzien und Enzym an.

PCR Optimierung

In der Praxis kann PCR aus verschiedenen Gründen teilweise wegen seiner Empfindlichkeit zur Verunreinigungsverursachen-Erweiterung von unechten DNA-Produkten scheitern. Wegen dessen sind mehrere Techniken und Verfahren entwickelt worden, um PCR Bedingungen zu optimieren. Die Verunreinigung mit der fremden DNA wird mit Laboratorium-Protokollen und Verfahren gerichtet, die pre-PCR Mischungen von potenziellen DNA-Verseuchungsstoffen trennen. Das schließt gewöhnlich Raumtrennung von PCR-Einstellungsgebieten von Gebieten für Analyse oder Reinigung von PCR Produkten, Gebrauch von verfügbarem plasticware und gründlich Reinigung der Arbeitsoberfläche zwischen Reaktionseinstellungen ein. Zündvorrichtungsdesign-Techniken sind in der Besserung des PCR Produktertrags und im Vermeiden der Bildung von unechten Produkten wichtig, und der Gebrauch von abwechselnden Pufferbestandteilen oder polymerase Enzymen kann mit der Erweiterung von langen oder sonst problematischen Gebieten der DNA helfen. Die Hinzufügung von Reagenzien, wie formamide, in Puffersystemen kann die Genauigkeit und den Ertrag von PCR vergrößern. Computersimulationen von theoretischen PCR-Ergebnissen (Elektronischer PCR) können durchgeführt werden, um beim Zündvorrichtungsdesign zu helfen.

Anwendung von PCR

Auswählende DNA-Isolierung

PCR erlaubt Isolierung von DNA-Bruchstücken von der genomic DNA durch die auswählende Erweiterung eines spezifischen Gebiets der DNA. Dieser Gebrauch von PCR vermehrt viele Methoden, wie das Erzeugen von Kreuzungsuntersuchungen für die Südliche oder nördliche Kreuzung und DNA-Klonen, die größere Beträge der DNA verlangen, ein spezifisches DNA-Gebiet vertretend. PCR liefert diese Techniken mit hohen Beträgen der reinen DNA, Analyse von DNA-Proben sogar von sehr kleinen Beträgen des Ausgangsmaterials ermöglichend.

Andere Anwendungen von PCR schließen DNA sequencing ein, um unbekannte PCR-verstärkte Folgen zu bestimmen, in denen der Erweiterungszündvorrichtungen in Sanger sequencing, Isolierung einer DNA-Folge verwendet werden kann, um recombinant DNA-Technologien zu beschleunigen, die mit der Einfügung einer DNA-Folge in einen plasmid oder das genetische Material eines anderen Organismus verbunden sind. Bakterienkolonien (E. coli) können durch PCR für richtige DNA-Vektor-Konstruktionen schnell geschirmt werden. PCR kann auch für den genetischen Fingerabdruck verwendet werden; eine forensische Technik hat gepflegt, eine Person oder Organismus durch das Vergleichen der experimentellen DNA durch verschiedene PCR-basierte Methoden zu erkennen.

Einige PCR 'Fingerabdruck'-Methoden haben hohe unterscheidende Macht und können verwendet werden, um genetische Beziehungen zwischen Personen wie Elternteilkind oder zwischen Geschwister zu identifizieren, und werden in der Vaterschaft-Prüfung (Abb. 4) verwendet. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Entwicklungsbeziehungen unter Organismen zu bestimmen.

Erweiterung und Quantifizierung der DNA

Weil PCR die Gebiete der DNA verstärkt, die er ins Visier nimmt, kann PCR verwendet werden, um äußerst kleine Beträge der Probe zu analysieren. Das ist häufig für die forensische Analyse kritisch, wenn nur ein Spur-Betrag der DNA als Beweise verfügbar ist. PCR kann auch in der Analyse der alten DNA verwendet werden, die Zehntausende von Jahren ist. Diese PCR-basierten Techniken sind auf Tieren, wie ein vierzigtausendjähriges Mammut, und auch auf der menschlichen DNA in Anwendungen im Intervall von der Analyse von ägyptischen Mumien zur Identifizierung eines russischen Zaren erfolgreich verwendet worden.

Quantitative PCR Methoden erlauben der Bewertung des Betrags einer gegebenen Folge-Gegenwart in einer Probe — eine Technik, die häufig angewandt ist, Niveaus des Genausdrucks quantitativ zu bestimmen. Schritthaltender PCR ist ein feststehendes Werkzeug für die DNA-Quantifizierung, die die Anhäufung des DNA-Produktes nach jeder Runde der PCR Erweiterung misst.

• Siehe auch Gebrauch der DNA in der forensischen Entomologie

PCR in der Diagnose von Krankheiten

PCR erlaubt frühe Diagnose von bösartigen Krankheiten wie Leukämie und lymphomas, der zurzeit das entwickelte im höchsten Maße in der Krebs-Forschung ist und bereits alltäglich verwendet wird. (Sieh, dass die Studien, die im EUTOS Für den CML-Studienartikel an http://www.eutos.org/content/molecular_monitoring/information/pcr_testing/ zitiert sind, besonders 10-13 bemerken.) können PCR Feinproben direkt auf genomic DNA-Proben durchgeführt werden, um mit der Versetzung spezifische bösartige Zellen an einer Empfindlichkeit zu entdecken, die mindestens höher 10,000-fach ist als diese anderer Methoden.

PCR erlaubt auch Identifizierung von non-cultivatable oder langsam wachsenden Kleinstlebewesen wie Mycobacteria, anaerobic Bakterien oder Viren von Gewebekulturfeinproben und Tiermodellen. Die Basis für PCR diagnostische Anwendungen in der Mikrobiologie ist die Entdeckung von ansteckenden Agenten und das Urteilsvermögen von nichtpathogenen von pathogenen Beanspruchungen auf Grund von spezifischen Genen.

Viren-DNA kann durch PCR ebenfalls entdeckt werden. Die Zündvorrichtungen haben Bedürfnis verwendet, zu den ins Visier genommenen Folgen in der DNA eines Virus spezifisch zu sein, und der PCR kann für diagnostische Analysen oder DNA sequencing des Virengenoms verwendet werden. Die hohe Empfindlichkeit von PCR erlaubt Virus-Entdeckung bald nach Infektion und sogar vor dem Anfall der Krankheit. Solche frühe Entdeckung kann Ärzten eine bedeutende Leitung in der Behandlung geben. Der Betrag des Virus ("Virenlast") in einem Patienten kann auch durch die PCR-basierte DNA quantitation Techniken (sieh unten) gemessen werden.

Schwankungen auf der grundlegenden PCR Technik

• Mit dem Allel spezifischer PCR: Eine diagnostische oder klonende Technik, die auf einzelnem-nucleotide polymorphisms (SNPs) (Einzeln-Grundunterschiede in der DNA) gestützt ist. Es verlangt vorherige Kenntnisse einer DNA-Folge einschließlich Unterschiede zwischen Allelen, und verwendet Zündvorrichtungen, deren 3' Enden den SNP umfassen. Die PCR Erweiterung unter strengen Bedingungen ist in Gegenwart von einer Fehlanpassung zwischen Schablone und Zündvorrichtung viel weniger effizient, so gibt die erfolgreiche Erweiterung mit einer SNP-spezifischen Zündvorrichtung Anwesenheit des spezifischen SNP in einer Folge Zeichen. Sieh SNP genotyping für mehr Information.
• Zusammenbau PCR oder Polymerase Cycling Assembly (PCA): künstliche Synthese von langen DNA-Folgen durch das Durchführen von PCR auf einer Lache von langem oligonucleotides mit kurzen überlappenden Segmenten. Der Oligonucleotides-Stellvertreter zwischen Sinn- und Antisinnrichtungen und die überlappenden Segmente bestimmen die Ordnung der PCR Bruchstücke, dadurch auswählend das lange End-DNA-Produkt erzeugend.
• Asymmetrischer PCR: Bevorzugt verstärkt ein DNA-Ufer in einer doppelt gestrandeten DNA-Schablone. Es wird in sequencing und Kreuzungsuntersuchung verwendet, wo die Erweiterung von nur einem der zwei Ergänzungsufer erforderlich ist. PCR wird wie gewöhnlich, aber mit einem großen Übermaß an der Zündvorrichtung für das für die Erweiterung ins Visier genommene Ufer ausgeführt. Wegen der langsamen (arithmetischen) Erweiterung später in der Reaktion nachdem ist die Begrenzungszündvorrichtung verbraucht worden, Extrazyklen von PCR sind erforderlich. Eine neue Modifizierung auf diesem Prozess, bekannt als Geradlinig Nach Dem Exponential-PCR (SPÄT-PCR), verwendet eine Begrenzungszündvorrichtung mit einer höheren schmelzenden Temperatur (Tm) als die Überzündvorrichtung, um Reaktionsleistungsfähigkeit als die Begrenzungszündvorrichtungskonzentrationsabnahmen Mitte Reaktion aufrechtzuerhalten.
• Helicase-abhängige Erweiterung: Ähnlich traditionellem PCR, aber Gebrauch eine unveränderliche Temperatur, anstatt durch denaturation und Zyklen des Ausglühens/Erweiterung Rad zu fahren. DNA helicase, ein Enzym, das DNA abwickelt, wird im Platz von thermischem denaturation verwendet.
• Heißer Anfang PCR: Eine Technik, die nichtspezifische Erweiterung während der Initiale reduziert, hat Stufen des PCR aufgestellt. Es kann manuell durch die Heizung der Reaktionsbestandteile zur denaturation Temperatur (z.B, 95°C) vor dem Hinzufügen des polymerase durchgeführt werden. Spezialenzym-Systeme sind entwickelt worden, die die Tätigkeit des polymerase an der Umgebungstemperatur hemmen, entweder durch die Schwergängigkeit eines Antikörpers oder durch die Anwesenheit von covalently hat Hemmstoffe gebunden, die sich nur nach einem Hoch-Temperaturaktivierungsschritt abtrennen. Hot-start/cold-finish PCR wird mit der neuen Hybride polymerases erreicht, die an der Umgebungstemperatur untätig sind und sofort bei der Verlängerungstemperatur aktiviert werden.
• Mit der Zwischenfolge spezifischer PCR (ISSR): Eine PCR Methode für die DNA, die Fingerabdrücke macht, der Gebiete zwischen einfachen Folge-Wiederholungen verstärkt, um einen einzigartigen Fingerabdruck von verstärkten Bruchstück-Längen zu erzeugen.
• Umgekehrter PCR: Wird allgemein verwendet, um die angrenzenden Folgen um Genomic-Einsätze zu identifizieren. Es schließt eine Reihe des DNA-Verzehrens und selbst ligation ein, auf bekannte Folgen an jedem Ende der unbekannten Folge hinauslaufend.
• Ligation-vermittelter PCR: Verwendet kleine DNA linkers ligated zur DNA das vielfache Zündvorrichtungsausglühen von Interesse zur DNA linkers; es ist für die DNA sequencing, das Genom-Wandern und die DNA footprinting verwendet worden.
• Methylation-spezifischer PCR (MSP): Entwickelt von Stephen Baylin und Jim Herman in der Schule von Johns Hopkins der Medizin, und wird verwendet, um methylation von Inseln von CpG in der genomic DNA zu entdecken. DNA wird zuerst mit Natrium bisulfite behandelt, der unmethylated cytosine Basen zu uracil umwandelt, der durch PCR Zündvorrichtungen als thymine anerkannt wird. Zwei PCRs werden dann auf der modifizierten DNA mit Zündvorrichtungssätzen ausgeführt, die außer an irgendwelchen Inseln von CpG innerhalb der Zündvorrichtungsfolgen identisch sind. An diesen Punkten erkennt ein Zündvorrichtungssatz DNA mit cytosines an, methylated DNA zu verstärken, und ein Satz erkennt DNA mit uracil oder thymine an, unmethylated DNA zu verstärken. MSP, der qPCR verwendet, kann auch durchgeführt werden, um quantitative aber nicht qualitative Information über methylation zu erhalten.
• Minizündvorrichtung PCR: Verwendet einen thermostable polymerase (S-Tbr), der sich von kurzen Zündvorrichtungen ("smalligos") mindestens 9 oder 10 nucleotides ausstrecken kann. Diese Methode erlaubt PCR, der zur kleineren Zündvorrichtung verbindliche Gebiete ins Visier nimmt und wird verwendet, um erhaltene DNA-Folgen, wie die 16 (oder eukaryotic 18) rRNA Gen zu verstärken.
• Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA): Erlaubnisse vielfache Ziele, die mit nur einem einzelnen Zündvorrichtungspaar zu verstärken sind, so die Entschlossenheitsbeschränkungen von Mehrfach-PCR (sieh unten) vermeidend.
• Mehrfach-PCR: Besteht aus vielfachen Zündvorrichtungssätzen innerhalb einer einzelnen PCR Mischung, um amplicons unterschiedlicher Größen zu erzeugen, die zu verschiedenen DNA-Folgen spezifisch sind. Durch das Zielen vielfacher Gene sofort kann Zusatzinformation von einer testgeführten Single gewonnen werden, der sonst mehrere Male verlangen würde, dass die Reagenzien und mehr Zeit leisten. Das Ausglühen von Temperaturen für jeden der Zündvorrichtungssätze muss optimiert werden, um richtig innerhalb einer einzelnen Reaktion und amplicon Größen zu arbeiten. D. h. ihre Grundpaar-Länge sollte verschieden genug sein, um verschiedene Bänder, wenn vergegenwärtigt, durch die Gel-Elektrophorese zu bilden.
• Verschachtelter PCR: Vergrößert die Genauigkeit der DNA-Erweiterung, durch das Reduzieren des Hintergrunds wegen der nichtspezifischen Erweiterung der DNA. Zwei Sätze von Zündvorrichtungen werden in zwei aufeinander folgenden PCRs verwendet. In der ersten Reaktion wird ein Paar von Zündvorrichtungen verwendet, um DNA-Produkte zu erzeugen, die außer dem beabsichtigten Ziel, noch aus nichtspezifisch verstärkten DNA-Bruchstücken bestehen kann. Das Produkt (E) wird dann in einem zweiten PCR mit einer Reihe von Zündvorrichtungen verwendet, deren verbindliche Seiten völlig oder teilweise verschieden davon sind und sich 3' jeder der in der ersten Reaktion verwendeten Zündvorrichtungen niedergelassen haben. Verschachtelter PCR ist häufig in spezifisch der Verstärkung langer DNA-Bruchstücke erfolgreicher als herkömmlicher PCR, aber es verlangt ausführlichere Kenntnisse der Zielfolgen.
• Übergreifen-Erweiterung PCR oder das Verstärken durch die Übergreifen-Erweiterung (SOE): Eine Gentechnologie-Technik, die verwendet wird, um zusammen zwei oder mehr DNA-Bruchstücke zu spleißen, die Ergänzungsfolgen enthalten. Es wird verwendet, um sich DNA-Stücken anzuschließen, die Gene, Durchführungsfolgen oder Veränderungen enthalten; die Technik ermöglicht Entwicklung von spezifischen und langen DNA-Konstruktionen.
• Quantitativer PCR (Q-PCR): Verwendet, um die Menge eines PCR Produktes (allgemein in Realtime) zu messen. Es misst quantitativ Startbeträge der DNA, cDNA, oder RNS. Q-PCR wird allgemein verwendet, um zu bestimmen, ob eine DNA-Folge in einer Probe und der Zahl seiner Kopien in der Probe da ist. Quantitativer schritthaltender PCR hat einen sehr hohen Grad der Präzision. QRT-PCR (oder QF-PCR) Methoden verwenden Leuchtstofffärbemittel, wie Sybr Green, EvaGreen oder DNA-Untersuchungen wie TaqMan fluorophore-enthaltend, um den Betrag des verstärkten Produktes in Realtime zu messen. Es wird auch manchmal zu RT-PCR (Echtzeit-PCR) oder RQ-PCR abgekürzt. QRT-PCR oder RTQ-PCR sind passendere Zusammenziehungen, da sich RT-PCR allgemein bezieht, um Abschrift PCR (sieh unten), häufig verwendet in Verbindung mit Q-PCR umzukehren.
• Rückabschrift PCR (RT-PCR): Um DNA von der RNS zu verstärken. Rücktranscriptase-Rückseite schreibt RNS in cDNA ab, der dann durch PCR verstärkt wird. RT-PCR wird im Kopierfräs-Ausdruck weit verwendet, um den Ausdruck eines Gens zu bestimmen oder die Folge einer RNS-Abschrift, einschließlich des Abschrift-Anfangs und der Beendigungsseiten zu identifizieren. Wenn die genomic DNA-Folge eines Gens bekannt ist, kann RT-PCR verwendet werden, um die Position von exons und introns im Gen kartografisch darzustellen. Das 5' Ende eines Gens (entsprechend der Abschrift-Anfang-Seite) wird normalerweise durch die RASSE-PCR (Schnelle Erweiterung von CDNA-Enden) identifiziert.
• Feste Phase PCR: Umfasst vielfache Bedeutungen, einschließlich der Polony Erweiterung (wo PCR Kolonien in einer Gel-Matrix, zum Beispiel abgeleitet werden), Brücke PCR (sind Zündvorrichtungen covalently, der mit einer Oberfläche der festen Unterstützung verbunden ist), herkömmliche Feste Phase PCR (wo Asymmetrisch, PCR wird in Gegenwart von der festen Unterstützung angewandt, die Zündvorrichtung mit der Folge trägt, die eine der wässrigen Zündvorrichtungen vergleicht) und Erhöhte Feste Phase PCR (wo herkömmliche Feste Phase PCR kann durch die Beschäftigung hohen Tm verbessert werden und hat feste Unterstützungszündvorrichtung mit der fakultativen Anwendung eines Thermal'Schritts' verschachtelt, feste Unterstützungszündung zu bevorzugen).
• Thermisch asymmetrisch hat PCR (SCHWANZ-PCR) verflochten: Für die Isolierung einer unbekannten Folge, die eine bekannte Folge flankiert. Innerhalb der bekannten Folge verwendet SCHWANZ-PCR ein verschachteltes Paar von Zündvorrichtungen mit dem sich unterscheidenden, der Temperaturen ausglüht; eine degenerierte Zündvorrichtung wird verwendet, um in der anderen Richtung von der unbekannten Folge ausführlicher zu erläutern.
• Touchdown PCR (Abwärts-PCR): Eine Variante von PCR, der zum Ziel hat, nichtspezifischen Hintergrund durch das allmähliche Senken der Ausglühen-Temperatur als PCR Rad fahrende Fortschritte zu reduzieren. Die Ausglühen-Temperatur an den anfänglichen Zyklen ist gewöhnlich einige Grade, die über dem T der verwendeten Zündvorrichtungen (3-5°C) sind), während an den späteren Zyklen es einige Grade sind, die unter der Zündvorrichtung T (3-5°C) sind). Die höheren Temperaturen geben größere Genauigkeit für die Zündvorrichtungsschwergängigkeit, und die niedrigeren Temperaturen erlauben effizientere Erweiterung von den spezifischen während der anfänglichen Zyklen gebildeten Produkten.
• Pan-AC: Verwendet isothermische Bedingungen für die Erweiterung, und kann in lebenden Zellen verwendet werden.
• Das universale Schnelle Wandern: Für das Genom-Wandern und den genetischen Fingerabdruck mit einem spezifischeren 'zweiseitigen' PCR als herkömmliche 'einseitige' Annäherungen (nur eine genspezifische Zündvorrichtung und eine allgemeine Zündvorrichtung verwendend —, der zu artefactual 'Geräusch' führen kann), auf Grund von einem Mechanismus, der Lasso-Struktur-Bildung einschließt. Stromlinienförmige Ableitungen von UFW sind WUT von LaNe (Lasso-Abhängiger hat PCR für die schnelle Erweiterung von genomic DNA-Enden verschachtelt), 5'RACE LaNe und 3'RACE LaNe.
• In silico PCR (digitaler PCR, virtueller PCR, elektronischer PCR, e-PCR) verweist auf rechenbetonte Werkzeuge, die verwendet sind, theoretische polymerase Kettenreaktionsergebnisse mit einem gegebenen Satz von Zündvorrichtungen (Untersuchungen) zu berechnen, um DNA-Folgen von einem sequenced Genom oder transcriptome zu verstärken.

Geschichte

Eine 1971-Zeitung in der Zeitschrift der Molekularen Biologie durch Kleppe und Mitarbeiter hat zuerst eine Methode mit einer enzymatischen Feinprobe beschrieben, um eine kurze DNA-Schablone mit Zündvorrichtungen in vitro zu wiederholen. Jedoch hat diese frühe Manifestation des grundlegenden PCR Grundsatzes viel Aufmerksamkeit nicht erhalten, und die Erfindung der polymerase Kettenreaktion 1983 wird allgemein Kary Mullis kreditiert.

Als Mullis den PCR 1983 entwickelt hat, arbeitete er in Emeryville, Kalifornien für Cetus Corporation, eine der ersten Biotechnologie-Gesellschaften. Dort war er dafür verantwortlich, kurze Ketten der DNA zu synthetisieren. Mullis hat geschrieben, dass er PCR empfangen hat, während er entlang der Pazifischen Küste-Autobahn eines Nachts in seinem Auto eine Kreuzfahrt gemacht hat. Er spielte in seiner Meinung mit einer neuen Weise, Änderungen (Veränderungen) in der DNA zu analysieren, als er begriffen hat, dass er stattdessen eine Methode erfunden hatte, jedes DNA-Gebiet durch wiederholte Zyklen der Verdoppelung zu verstärken, die durch die DNA polymerase gesteuert ist. Im Wissenschaftlichen Amerikaner hat Mullis das Verfahren zusammengefasst: "Mit einem einzelnen Molekül der genetischen materiellen DNA beginnend, kann der PCR 100 Milliarden ähnliche Moleküle an einem Nachmittag erzeugen. Die Reaktion ist leicht durchzuführen. Es verlangt nicht mehr als ein Reagenzglas, einige einfache Reagenzien und eine Quelle der Hitze." Er wurde dem Nobelpreis in der Chemie 1993 für seine Erfindung sieben Jahre zuerkannt, nachdem er und seine Kollegen an Cetus zuerst seinen Vorschlag stellen sich zu üben. Jedoch sind einige Meinungsverschiedenheiten über die intellektuellen und praktischen Beiträge anderer Wissenschaftler zur Arbeit von Mullis geblieben, und ob er der alleinige Erfinder des PCR Grundsatzes (sieh unten) gewesen war.

Am Kern der PCR Methode ist der Gebrauch einer passenden DNA polymerase fähig, den hohen Temperaturen> erforderlich für die Trennung der zwei DNA-Ufer in der DNA doppelte Spirale nach jedem Erwiderungszyklus zu widerstehen. Die DNA polymerases am Anfang verwendet für in Vitro-Experimenten, die PCR vorhersagen, war unfähig, diesen hohen Temperaturen zu widerstehen. So waren die frühen Verfahren für die DNA-Erwiderung sehr ineffizient und zeitaufwendig, und haben große Beträge der DNA polymerase und des dauernden Berührens während des Prozesses verlangt.

Die Entdeckung 1976 Taq polymerase — eine DNA polymerase hat sich von der thermophilic Bakterie, Thermus aquaticus geläutert, der natürlich im heißen lebt Umgebungen wie heiße Frühlinge — haben für dramatische Verbesserungen der PCR Methode den Weg geebnet. Die DNA polymerase isoliert von T. aquaticus ist bei hohen Temperaturen stabil, die aktiv sogar nach der DNA denaturation so bleiben, das Bedürfnis begegnend, neue DNA polymerase nach jedem Zyklus hinzuzufügen. Das hat einen automatisierten mit Sitz in thermocycler Prozess für die DNA-Erweiterung erlaubt.

Offene Kriege

Die PCR Technik wurde von Kary Mullis patentiert und Cetus Corporation zugeteilt, wo Mullis gearbeitet hat, als er die Technik 1983 erfunden hat. Das Enzym von Taq polymerase wurde auch durch Patente bedeckt. Es hat mehrere bemerkenswerte Rechtssachen gegeben, die mit der Technik einschließlich einer erfolglosen von DuPont gebrachten Rechtssache verbunden sind. Der pharmazeutische Hoffmann-La Firmenroche hat die Rechte auf die Patente 1992 gekauft und hält zurzeit diejenigen, die noch geschützt werden.

Ein zusammenhängender offener Kampf über das Enzym von Taq polymerase ist noch in mehreren Rechtsprechungen um die Welt zwischen Roche und Promega andauernd. Die gesetzlichen Argumente haben sich außer den Leben des ursprünglichen PCR und der Patente von Taq polymerase ausgestreckt, die am 28. März 2005 abgelaufen sind.

Links

• US-Patent für PCR
• Stiefdurch den Zeichentrickfilm von PCR - Kaltes Frühlingshafen-Laboratorium
• OpenWetWare
• Die Geschichte der Polymerase Kettenreaktion von der Smithsonian Einrichtung archiviert