Eine Zündvorrichtung ist ein Ufer von Nukleinsäure, die als ein Startpunkt für die DNA-Synthese dient. Sie sind für die DNA-Erwiderung erforderlich, weil die Enzyme, die diesen Prozess, DNA polymerases katalysieren, nur neuen nucleotides zu einem vorhandenen Ufer der DNA hinzufügen können. Der polymerase fängt Erwiderung am 3 '-Ende der Zündvorrichtung und Kopien das entgegengesetzte Ufer an.

In den meisten Fällen der natürlichen DNA-Erwiderung ist die Zündvorrichtung für die DNA-Synthese und Erwiderung ein kurzes Ufer der RNS (der de novo gemacht werden kann).

Viele der Labortechniken der Biochemie und molekularen Biologie, die mit DNA polymerase, wie DNA sequencing und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verbunden sind, verlangen DNA-Zündvorrichtungen. Diese Zündvorrichtungen sind gewöhnlich kurz, chemisch hat oligonucleotides mit einer Länge von ungefähr zwanzig Basen synthetisiert. Sie werden zu einer Ziel-DNA gekreuzt, die dann durch den polymerase kopiert wird.

Mechanismus in vivo

Das langsam vergehende Ufer ist, dass das Ufer der DNA Spirale verdoppelt, die in 5' zu 3' Weise orientiert wird. Deshalb muss seine Ergänzung in 3' 5' Weise synthetisiert werden. Weil DNA polymerase III in den 3' 5' Richtung nicht synthetisieren kann, wird das langsam vergehende Ufer in kurzen als Bruchstücke von Okazaki bekannten Segmenten synthetisiert. Entlang der Schablone des langsam vergehenden Ufers baut primase RNS-Zündvorrichtungen in kurzen Brüchen. DNA polymerases ist dann im Stande, die freien 3 '-OH Gruppen auf den RNS-Zündvorrichtungen zu verwenden, um DNA in den 5' 3' Richtung zu synthetisieren.

Die RNS-Bruchstücke werden dann durch die DNA polymerase I für prokaryotes entfernt, oder DNA polymerase δ für eukaryotes (werden verschiedene Mechanismen in eukaryotes und prokaryotes verwendet), und neue deoxyribonucleotides werden hinzugefügt, um die Lücken zu schließen, wo die RNS da gewesen ist. DNA ligase schließt sich dann dem deoxyribonucleotides zusammen an, die Synthese des langsam vergehenden Ufers vollendend.

Zündvorrichtungseliminierung

In der eukaryotic Zündvorrichtungseliminierung erweitert DNA polymerase δ das Bruchstück von Okazaki in 5' zu 3' Richtung, und wenn es auf die RNS-Zündvorrichtung vom vorherigen Bruchstück von Okazaki stößt, das 5  Ende der Zündvorrichtung in einen einzeln gestrandeten RNS-Schlag versetzend, der durch die nuclease Spaltung entfernt wird. Die Spaltung der RNS-Schläge schließt entweder endonuclease 1 (FEN1) Spaltung von kurzen Schlägen oder Überzug von langen Schlägen durch die einzeln gestrandete DNA verbindliches Erwiderungsprotein-Protein A (RPA) und folgende Spaltung durch Dna2 nuclease und FEN1 ein.

Dieser Mechanismus ist eine potenzielle Erklärung dazu, wie HIV-Virus sein Genom in die doppelte gestrandete DNA von der nach der Rückabschrift seiner RNS gebildeten RNS-DNA umgestalten kann. Jedoch hat die HIV-VERSCHLÜSSELTE Rückseite transcriptase eigene ribonuclease Tätigkeit, die die Viren-RNS während der Synthese von cDNA, sowie von der DNA ABHÄNGIGE DNA polymerase Tätigkeit erniedrigt, die den Sinn cDNA Ufer in eine Antisinn-DNA kopiert, um ein doppelt gestrandetes DNA-Zwischenglied zu bilden.

Gebrauch von synthetischen Zündvorrichtungen

DNA sequencing wird verwendet, um den nucleotides in einem DNA-Ufer zu bestimmen; die Kettenbeendigungsmethode (dideoxy sequencing oder Methode von Sanger) verwenden eine Zündvorrichtung als ein Anfang-Anschreiber für die Kettenreaktion.

In PCR werden Zündvorrichtungen verwendet, um das durch den PCR-Prozess zu verstärkende DNA-Bruchstück zu bestimmen. Die Länge von Zündvorrichtungen ist gewöhnlich nicht mehr als 30 (gewöhnlich 18-24) nucleotides, und sie müssen den Anfang und das Ende des zu verstärkenden DNA-Bruchstücks vergleichen. Sie leiten Erwiderung zu einander - die Erweiterung einer Zündvorrichtung durch polymerase wird dann die Schablone für den anderen, zu einer Exponentialzunahme im Zielsegment führend.

Es lohnt sich zu bemerken, dass Zündvorrichtungen im Wesentlichen immer für die DNA-Synthese nicht notwendig sind und tatsächlich durch Virenpolymerases, z.B Grippe für die RNS-Synthese verwendet werden können.

PCR Zündvorrichtungsdesign

Paare von Zündvorrichtungen sollten ähnliche schmelzende Temperaturen seit dem Ausglühen in einem PCR haben kommt für beide gleichzeitig vor. Eine Zündvorrichtung mit einem T bedeutsam höher als die Ausglühen-Temperatur der Reaktion kann mishybridize und sich an einer falschen Position entlang der DNA-Folge ausstrecken, während T bedeutsam tiefer als die Ausglühen-Temperatur scheitern kann, auszuglühen und sich überhaupt auszustrecken.

Zündvorrichtungsfolgen müssen gewählt werden, um für ein Gebiet der DNA einzigartig auszuwählen, die Möglichkeit von mishybridization zu einer ähnlichen Folge in der Nähe vermeidend. Eine allgemein verwendete Methode ist DRUCKWELLE-Suche, wodurch alle möglichen Gebiete, zu denen eine Zündvorrichtung binden kann, gesehen werden können. Beide die nucleotide Folge sowie die Zündvorrichtung selbst können gesuchte DRUCKWELLE sein. Die freie NCBI Werkzeug-Zündvorrichtungs-Druckwelle integriert Zündvorrichtungsdesignwerkzeug und DRUCKWELLE-Suche in eine Anwendung, so kommerzielles Softwareprodukt wie Bakenentwerfer. Computersimulationen von theoretischen PCR-Ergebnissen (Elektronischer PCR) können durchgeführt werden, um beim Zündvorrichtungsdesign zu helfen. Wiederholungen von Mononucleotide sollten vermieden werden, weil Schleife-Bildung vorkommen und zu mishybridization beitragen kann. Zündvorrichtungen sollten mit anderen Zündvorrichtungen in der Mischung (entweder andere Kopien von demselben oder die Rückwartsrichtungszündvorrichtung) nicht leicht ausglühen; dieses Phänomen kann zur Produktion der 'Zündvorrichtung dimer' Produkte führen, die die Mischung verseuchen. Zündvorrichtungen sollten auch stark zu sich nicht ausglühen, weil innere Haarnadeln und Schleifen das Ausglühen mit der Schablone-DNA hindern konnten.

man eine Zündvorrichtung für den Gebrauch im TA-Klonen entwirft, kann Leistungsfähigkeit durch das Hinzufügen von AG Schwänzen zu den 5' und das 3' Ende vergrößert werden.

Die Rückzündvorrichtung muss die Rückergänzung der gegebenen cDNA Folge sein. Die Rückergänzung kann z.B mit Online-Rechenmaschinen leicht bestimmt werden.

Degenerierte Zündvorrichtungen

Manchmal werden degenerierte Zündvorrichtungen verwendet. Das sind wirklich Mischungen von ähnlichen, aber nicht identische Zündvorrichtungen. Sie können günstig sein, wenn dasselbe Gen von verschiedenen Organismen verstärkt werden soll, wie die Gene selbst wahrscheinlich ähnlich, aber nicht identisch sind. Der andere Gebrauch für degenerierte Zündvorrichtungen besteht darin, wenn Zündvorrichtungsdesign auf der Protein-Folge basiert. Da mehrere verschiedene codons für eine Aminosäure codieren können, ist es häufig schwierig abzuleiten, welcher codon in einem besonderen Fall verwendet wird. Deshalb könnte die Zündvorrichtungsfolge entsprechend der Aminosäure isoleucine "ATH", wo Standplätze für das Adenin, T für thymine, und H für das Adenin, thymine, oder cytosine gemäß dem genetischen Code für jeden codon mit den IUPAC Symbolen für degenerierte Basen sein. Der Gebrauch von degenerierten Zündvorrichtungen kann die Genauigkeit der PCR Erweiterung außerordentlich reduzieren. Das Problem kann durch das Verwenden des Touchdowns PCR teilweise behoben werden.

Degenerierte Zündvorrichtungen werden weit verwendet und im Feld der mikrobischen Ökologie äußerst nützlich. Sie berücksichtigen die Erweiterung von Genen von so weit unkultivierten Kleinstlebewesen oder erlauben die Wiederherstellung von Genen von Organismen, wo genomic Information nicht verfügbar ist. Gewöhnlich werden degenerierte Zündvorrichtungen durch das Übereinstimmen des Gens sequencing gefunden in GenBank entworfen. Unterschiede unter Folgen werden durch das Verwenden der IUPAC Entartung für individuelle Basen verantwortlich gewesen. PCR Zündvorrichtungen werden dann als eine Mischung von Zündvorrichtungen entsprechend allen Versetzungen synthetisiert.

Siehe auch

Synthese von Oligonucleotide, die Methoden, durch die Zündvorrichtungen verfertigt werden

Links

• T Rechenmaschine
• Primer3
• Zündvorrichtungs-Druckwelle