Der Westklecks (hat manchmal das Protein immunoblot genannt), ist eine weit verwendete analytische Technik, die verwendet ist, um spezifische Proteine in der gegebenen Probe des Gewebes homogenate oder Extrakts zu entdecken. Es verwendet Gel-Elektrophorese, um heimische Proteine durch die 3. Struktur oder denaturierte Proteine durch die Länge des polypeptide zu trennen. Die Proteine werden dann einer Membran übertragen (normalerweise nitrocellulose oder PVDF), wo sie (entdeckte) zum Zielprotein spezifische Verwenden-Antikörper untersucht werden.

Es gibt jetzt viele Reagens-Gesellschaften, die sich auf die Versorgung von Antikörpern (sowohl monoclonal als auch polyclonal Antikörper) gegen Zehntausende von verschiedenen Proteinen spezialisieren. Kommerzielle Antikörper können teuer sein, obwohl der ungebundene Antikörper zwischen Experimenten wiederverwendet werden kann. Diese Methode wird in den Feldern der molekularen Biologie, Biochemie, immunogenetics und anderen molekularen Biologie-Disziplinen verwendet.

Andere zusammenhängende Techniken schließen Verwenden-Antikörper ein, um Proteine in Geweben und Zellen durch immunostaining und Enzym-verbundene Immunosorbent-Feinprobe (ELISA) zu entdecken.

Die Methode ist im Laboratorium von George Stark an Stanford entstanden. Der Name wurde Westklecks der Technik von W. Neal Burnette und Sushant Bhat gegeben und ist ein Spiel auf dem Namen Klecks von Southern, eine Technik für die DNA-Entdeckung entwickelt früher von Edwin Southern. Die Entdeckung der RNS wird nördlicher Klecks genannt.

Schritte in einem Westklecks

Gewebevorbereitung

Proben können vom ganzen Gewebe oder von der Zellkultur nicht genommen werden. Feste Gewebe werden zuerst mechanisch mit einem Mixer (für größere Beispielvolumina), mit einem homogenizer (kleinere Volumina), oder durch sonication gebrochen. Zellen können auch durch eine der obengenannten mechanischen Methoden aufgebrochen werden. Jedoch können Virus oder Umweltproben die Quelle des Proteins sein, und so wird das Westbeflecken auf Zellstudien nur nicht eingeschränkt.

Geordnete Reinigungsmittel, Salze und Puffer können verwendet werden, um lysis von Zellen und zu solubilize Proteinen zu fördern. Machen Sie Spaß pro-, und phosphatase Hemmstoffe werden häufig hinzugefügt, um das Verzehren der Probe durch seine eigenen Enzyme zu verhindern. Gewebevorbereitung wird häufig bei kalten Temperaturen getan, um das Protein-Denaturieren und die Degradierung zu vermeiden.

Eine Kombination von biochemischen und mechanischen Techniken - dem Enthalten verschiedener Typen des Filtrierens und centrifugation - kann verwendet werden, um verschiedene Zellabteilungen und organelles zu trennen.

Gel-Elektrophorese

Die Proteine der Probe werden mit der Gel-Elektrophorese getrennt. Die Trennung von Proteinen kann durch den Isoelectric-Punkt (Pi), Molekulargewicht, elektrische Anklage oder eine Kombination dieser Faktoren sein. Die Natur der Trennung hängt von der Behandlung der Probe und der Natur des Gels ab. Das ist eine sehr nützliche Weise, ein Protein zu identifizieren.

Bei weitem verwendet der allgemeinste Typ der Gel-Elektrophorese polyacrylamide Gele und mit dem Natrium dodecyl Sulfat (SDS) geladene Puffer. SDS-SEITIG (SDS polyacrylamide Gel-Elektrophorese) erhält polypeptides in einem denaturierten Staat aufrecht, sobald sie mit starken abnehmenden Agenten behandelt worden sind, um sekundäre und tertiäre Struktur zu entfernen (z.B Disulfid-Obligationen [S-S] zu sulfhydryl Gruppen [SCH und SCH]) und so Trennung von Proteinen durch ihr Molekulargewicht erlaubt. Probierte Proteine belegen sich im negativ beladenen SDS und bewegen sich zur positiv beladenen Elektrode durch das acrylamide Ineinandergreifen des Gels. Kleinere Proteine wandern schneller durch dieses Ineinandergreifen ab, und die Proteine werden so gemäß der Größe (gewöhnlich gemessen in kilodaltons, kDa) getrennt. Die Konzentration von acrylamide bestimmt die Entschlossenheit des Gels - das größere die acrylamide Konzentration besser die Entschlossenheit von niedrigeren Molekulargewicht-Proteinen. Tiefer die acrylamide Konzentration besser die Entschlossenheit von höheren Molekulargewicht-Proteinen. Proteine reisen nur in einer Dimension entlang dem Gel für die meisten Kleckse.

Proben werden in Bohrlöcher im Gel geladen. Eine Gasse wird gewöhnlich für einen Anschreiber oder Leiter, eine gewerblich verfügbare Mischung von Proteinen vorbestellt, die Molekulargewichte, normalerweise befleckt definiert haben, um sichtbare, farbige Bänder zu bilden. Wenn Stromspannung entlang dem Gel angewandt wird, wandern Proteine darin mit verschiedenen Geschwindigkeiten ab. Diese verschiedenen Raten der Förderung (verschiedener electrophoretic mobilities) trennen sich in Bänder innerhalb jeder Gasse.

Es ist auch möglich, ein zweidimensionales (2.) Gel zu verwenden, das die Proteine von einer aussuchen Probe in zwei Dimensionen ausbreitet. Proteine werden gemäß dem Isoelectric-Punkt getrennt (pH, an dem sie neutrale Nettoanklage haben) in der ersten Dimension, und gemäß ihrem Molekulargewicht in der zweiten Dimension.

Übertragung

Um die Proteine zugänglich für die Antikörper-Entdeckung zu machen, werden sie aus dem Gel auf eine Membran bewegt, die aus nitrocellulose oder polyvinylidene difluoride (PVDF) gemacht ist. Die primäre Methode, für die Proteine zu übertragen, wird electroblotting genannt und verwendet einen elektrischen Strom, um Proteine vom Gel in den PVDF oder die nitrocellulose Membran zu ziehen. Die Proteine bewegen sich aus dem Gel auf die Membran, während sie die Organisation unterstützen, die sie innerhalb des Gels hatten. Eine ältere Methode der Übertragung schließt das Stellen einer Membran oben auf dem Gel und eines Stapels von Filterpapieren oben darauf ein. Der komplette Stapel wird in eine Pufferlösung gelegt, die den Vortrag von der kapillaren Handlung heranbringt, die Proteine damit bringend. In der Praxis wird diese Methode nicht verwendet, weil man zu viel Zeit braucht; electroblotting wird bevorzugt. Infolge jedes "Beflecken"-Prozesses werden die Proteine auf einer dünnen Oberflächenschicht für die Entdeckung (sieh unten) ausgestellt. Beide Varianten der Membran werden für ihr nichtspezifisches Protein verbindliche Eigenschaften gewählt (d. h. bindet alle Proteine ebenso gut). Protein-Schwergängigkeit basiert auf hydrophobe Wechselwirkungen, sowie beladene Wechselwirkungen zwischen der Membran und dem Protein. Membranen von Nitrocellulose sind preiswerter als PVDF, aber sind viel zerbrechlicher und stehen gut zu wiederholtem probings nicht auf.

Die Gleichförmigkeit und gesamte Wirksamkeit der Übertragung des Proteins vom Gel bis die Membran können durch die Färbung der Membran mit Coomassie Brilliant Blau oder Ponceau S Färbemittel überprüft werden. Ponceau S ist die allgemeineren von den zwei, wegen seiner höheren Empfindlichkeit und Wasserlöslichkeit, das letzte Bilden davon leichter zu nachher destain, und untersuchen Sie die Membran, wie beschrieben, unten.

Das Blockieren

Seitdem die Membran für seine Fähigkeit gewählt worden ist, Protein zu binden, und weil beide Antikörper und das Ziel Proteine sind, müssen Schritte gemacht werden, um Wechselwirkungen zwischen der Membran und dem für die Entdeckung des Zielproteins verwendeten Antikörper zu verhindern. Das Blockieren der nichtspezifischen Schwergängigkeit wird durch das Stellen der Membran in einer verdünnten Lösung des Proteins - normalerweise Rinderserum-3-5-%-Albumin (BSA) oder fettfreie trockene Milch erreicht (beide sind billig) in Tris-Buffered Saline (TBS), mit einem Minutenprozentsatz Reinigungsmittel wie Tween 20 oder Triton X-100. Das Protein in der verdünnten Lösung haftet der Membran in allen Plätzen an, wo die Zielproteine nicht angehaftet haben. So, wenn der Antikörper hinzugefügt wird, gibt es kein Zimmer auf der Membran dafür, um anders anzuhaften, als auf den verbindlichen Seiten des spezifischen Zielproteins. Das reduziert "Geräusch" im Endprodukt des Westkleckses, zu klareren Ergebnissen führend, und beseitigt falschen positives.

Entdeckung

Während des Entdeckungsprozesses wird die Membran für das Protein von Interesse mit einem modifizierten Antikörper "untersucht", der mit einem Reporter-Enzym verbunden wird; wenn ausgestellt, zu einem passenden Substrat steuert dieses Enzym eine colourimetric Reaktion und erzeugt eine Farbe. Für eine Vielfalt von Gründen findet das traditionell in einem Zweipunktprozess statt, obwohl es jetzt schrittweise für bestimmte Anwendungen verfügbare Entdeckungsmethoden gibt.

Zwei Schritte

• Primärer Antikörper

Primäre Antikörper werden erzeugt, wenn eine Gastgeber-Art oder geschützte Zellkultur zum Protein von Interesse (oder ein Teil davon) ausgestellt werden. Normalerweise ist das ein Teil der geschützten Antwort, wohingegen hier sie geerntet und als empfindliche und spezifische Entdeckungswerkzeuge verwendet werden, die das Protein direkt binden.

Nach dem Blockieren wird eine verdünnte Lösung des primären Antikörpers (allgemein zwischen 0.5 und 5 micrograms/mL) mit der Membran unter der sanften Aufregung ausgebrütet. Gewöhnlich wird die Lösung aus der gepufferten Salzlösung mit einem kleinen Prozentsatz Reinigungsmittel, und manchmal mit bestäubter Milch oder BSA zusammengesetzt. Die Antikörper-Lösung und die Membran können gesiegelt und zusammen für überall von 30 Minuten zu über Nacht ausgebrütet werden. Es kann auch bei verschiedenen Temperaturen mit wärmeren Temperaturen ausgebrütet werden, die mit dem mehr verbindlichen, beiden spezifisch (zum Zielprotein, dem "Signal") und nichtspezifisch ("Geräusch") vereinigen werden.

• Sekundärer Antikörper

Nach dem Spülen der Membran, um losgebundenen primären Antikörper zu entfernen, wird die Membran zu einem anderen Antikörper ausgestellt, der an einem mit den Arten spezifischen Teil des primären Antikörpers geleitet ist. Antikörper kommen aus Tierquellen (oder Tier sourced hybridoma Kulturen); eine sekundäre Antimaus wird zu fast jeder Maus-sourced primären Antikörper binden, der einige Kostenersparnisse erlaubt, indem er einem kompletten Laboratorium erlaubt wird, eine einzelne Quelle des serienmäßig hergestellten Antikörpers zu teilen, und viel konsequentere Ergebnisse zur Verfügung stellt. Das ist als ein sekundärer Antikörper, und wegen seiner Zielen-Eigenschaften bekannt, neigt dazu, "Antimaus", "Antiziege" usw. genannt zu werden. Der sekundäre Antikörper wird gewöhnlich mit biotin oder mit einem Reporter-Enzym wie alkalischer phosphatase oder Meerrettich peroxidase verbunden. Das bedeutet, dass mehrere sekundäre Antikörper zu einem primärem Antikörper binden und das Signal erhöhen werden.

Meistens wird ein Meerrettich peroxidase-verbunden sekundär verwendet, um einen chemiluminescent Agenten zu zerspalten, und das Reaktionsprodukt erzeugt Lumineszenz im Verhältnis im Wert vom Protein. Eine empfindliche Platte des fotografischen Films wird gegen die Membran gelegt, und die Aussetzung vom Licht von der Reaktion schafft ein Image der zum Klecks gebundenen Antikörper. Eine preiswertere, aber weniger empfindliche Annäherung verwertet einen 4-chloronaphthol Fleck mit 1-%-Wasserstoffperoxid; die Reaktion von Peroxyd-Radikalen mit dem 4-chloronaphthol erzeugt einen dunkelpurpurroten Fleck, der fotografiert werden kann ohne zu verwenden, hat fotografischen Film spezialisiert.

Als mit dem ELISPOT und den ELISA Verfahren kann das Enzym mit einem Substrat-Molekül versorgt werden, das durch das Enzym zu einem farbigen Reaktionsprodukt umgewandelt wird, das auf der Membran sichtbar sein wird (sieh die Zahl unten mit blauen Bändern).

Eine andere Methode der sekundären Antikörper-Entdeckung verwertet einen nah-infraroten (NIR) fluorophore-verbundener Antikörper. Von der Erregung eines Leuchtstofffärbemittels erzeugtes Licht ist statisch, Leuchtstoffentdeckung ein genaueres und genaues Maß des Unterschieds im Signal erzeugt durch etikettierte Antikörper gebunden zu Proteinen auf einem Westklecks machend. Proteine können genau gemessen werden, weil das Signal, das durch die verschiedenen Beträge von Proteinen auf den Membranen erzeugt ist, in einem statischen Staat verglichen mit der Chemilumineszenz gemessen wird, in der Licht in einem dynamischen Staat gemessen wird.

Eine dritte Alternative soll ein radioaktives Etikett aber nicht ein Enzym verwenden, das mit dem sekundären Antikörper, wie das Beschriften eines Antikörper bindenden Proteins wie Staphylococcus Protein A oder Streptavidin mit einem radioaktiven Isotop des Jods verbunden ist. Da andere Methoden sicherer, schneller, und preiswerter sind, wird diese Methode jetzt selten verwendet; jedoch ist ein Vorteil dieser Annäherung die Empfindlichkeit der gestützten Autoröntgenografie darstellend, der hoch genaue Protein-Quantifizierung, wenn verbunden, mit der optischen Software ermöglicht (z.B. Optiquant).

Ein Schritt

Historisch wurde der Untersuchungsprozess in zwei Schritten wegen der Verhältnisbequemlichkeit durchgeführt, primäre und sekundäre Antikörper in getrennten Prozessen zu erzeugen. Das gibt Forschern und Vereinigungen riesige Vorteile in Bezug auf die Flexibilität und fügt hinzu, dass eine Erweiterung zum Entdeckungsprozess geht. In Anbetracht des Advents der Protein-Analyse des hohen Durchflusses und der niedrigeren Grenzen der Entdeckung, jedoch, hat es Interesse am Entwickeln schrittweiser forschend eindringender Systeme gegeben, die dem Prozess erlauben würden, schneller und mit weniger Verbrauchsmaterial vorzukommen. Das verlangt einen Untersuchungsantikörper, der sowohl das Protein von Interesse anerkennt als auch ein feststellbares Etikett, Untersuchungen enthält, die häufig für bekannte Protein-Anhängsel verfügbar sind. Die primäre Untersuchung wird mit der Membran ausgebrütet, die gewissermaßen dem für den primären Antikörper in einem Zweipunktprozess ähnlich ist, und ist dann zur direkten Entdeckung bereit, nachdem eine Reihe dessen Schritte wäscht.

Analyse

Nachdem die ungebundenen Untersuchungen abgewaschen werden, ist der Westklecks zur Entdeckung der Untersuchungen bereit, die etikettiert und zum Protein von Interesse gebunden werden. In praktischen Begriffen offenbaren nicht alle westerns Protein nur an einem Band in einer Membran. Größe-Annäherungen werden durch das Vergleichen der befleckten Bänder mit diesem des Anschreibers oder der während der Elektrophorese geladenen Leiter genommen. Der Prozess wird für ein Strukturprotein, wie actin oder tubulin wiederholt, der sich zwischen Proben nicht ändern sollte. Der Betrag des Zielproteins wird zum Strukturprotein normalisiert, um zwischen Gruppen zu kontrollieren. Diese Praxis sichert Korrektur für den Betrag des Gesamtproteins auf der Membran im Falle Fehler oder unvollständiger Übertragungen.

Entdeckung von Colorimetric

Die colorimetric Entdeckungsmethode hängt von Inkubation des Westkleckses mit einem Substrat ab, das mit dem Reporter-Enzym reagiert (wie peroxidase), der zum sekundären Antikörper gebunden wird. Das wandelt das auflösbare Färbemittel in eine unlösliche Form einer verschiedenen Farbe um, die sich neben dem Enzym niederschlägt und dadurch die Membran beschmutzt. Die Entwicklung des Kleckses wird dann durch das Abwaschen des auflösbaren Färbemittels angehalten. Protein-Niveaus werden durch densitometry bewertet (wie intensiv der Fleck ist), oder spectrophotometry.

Entdeckung von Chemiluminescent

Entdeckungsmethoden von Chemiluminescent hängen von Inkubation des Westkleckses mit einem Substrat ab, das luminesce, wenn ausgestellt, dem Reporter auf dem sekundären Antikörper wird. Das Licht wird dann durch den fotografischen Film, und mehr kürzlich durch CCD Kameras entdeckt, die ein Digitalimage des Westkleckses gewinnen. Das Image wird durch densitometry analysiert, der den Verhältnisbetrag der Protein-Färbung bewertet und die Ergebnisse in Bezug auf die optische Dichte misst. Neuere Software erlaubt weitere Datenanalyse wie Molekulargewicht-Analyse, wenn passende Standards verwendet werden.

Radioaktive Entdeckung

Radioaktive Etiketten verlangen Enzym-Substrate nicht, aber erlauben eher das Stellen des medizinischen Röntgenfilms direkt gegen den Westklecks, der sich entwickelt, weil es zum Etikett ausgestellt wird und dunkle Gebiete schafft, die den Protein-Bändern von Interesse entsprechen (sieh Image nach rechts). Die Wichtigkeit von radioaktiven Entdeckungsmethoden neigt sich wegen seiner gefährlichen Radiation, weil es sehr teuer ist, sind Gesundheit und Sicherheitsgefahren hoch, und ECL (erhöhte Chemilumineszenz) stellt eine nützliche Alternative zur Verfügung.

Leuchtstoffentdeckung

Die Leuchtstoff-etikettierte Untersuchung ist durch das Licht aufgeregt, und die Emission der Erregung wird dann durch einen Photosensor wie mit passenden Emissionsfiltern ausgestattete CCD-Kamera entdeckt, der ein Digitalimage des Westkleckses gewinnt und weitere Datenanalyse wie Molekulargewicht-Analyse und eine quantitative Westklecks-Analyse erlaubt. Wie man betrachtet, ist Fluoreszenz eine der besten Methoden für die Quantifizierung, aber ist weniger empfindlich als Chemilumineszenz.

Sekundäre Untersuchung

Ein Hauptunterschied zwischen nitrocellulose und PVDF Membranen bezieht sich auf die Fähigkeit von jedem, "ausziehende" Antikörper und das Wiederverwenden der Membran für nachfolgende Antikörper-Untersuchungen zu unterstützen. Während es feste Protokolle gibt, die verfügbar sind, um nitrocellulose Membranen abzuziehen, berücksichtigt der kräftigere PVDF das leichtere Abstreifen, und für mehr Wiedergebrauch vor Nebengeräusch-Grenze-Experimenten. Ein anderer Unterschied ist, dass, verschieden von nitrocellulose, PVDF 95-%-Vinylalkohol, isopropanol oder Methanol vor dem Gebrauch eingesaugt werden muss. PVDF Membranen neigen auch dazu, dicker und widerstandsfähiger zu sein, um während des Gebrauches zu beschädigen.

2. Gel-Elektrophorese

2-dimensionaler SDS-SEITIGER Gebrauch die Grundsätze und Techniken, die oben entworfen sind. 2. SDS-SEITIG, wie der Name darauf hinweist, schließt die Wanderung von polypeptides in 2 Dimensionen ein. Zum Beispiel in der ersten Dimension werden polypeptides gemäß dem Isoelectric-Punkt getrennt, während in der zweiten Dimension polypeptides gemäß ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Der isoelectric Punkt eines gegebenen Proteins wird durch die Verhältniszahl positiv (z.B lysine und arginine) und negativ (z.B glutamate und aspartate) beladene Aminosäuren mit negativ beladenen Aminosäuren bestimmt, die zu einem hohen Isoelectric-Punkt und positiv beladenen Aminosäuren beitragen, die zu einem niedrigen Isoelectric-Punkt beitragen. Proben konnten auch zuerst unter nichtabnehmenden Bedingungen getrennt werden, die SDS-SEITIG und unter abnehmenden Bedingungen in der zweiten Dimension verwenden, die Disulfid-Obligationen auseinander bricht, die Subeinheiten zusammenhalten. SDS-SEITIG könnte auch mit dem mit dem HARNSTOFF SEITIGEN für ein 2-dimensionales Gel verbunden werden.

Im Prinzip berücksichtigt diese Methode die Trennung aller Zellproteine auf einem einzelnen großen Gel. Ein Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie häufig zwischen verschiedenem isoforms eines besonderen Proteins - z.B ein Protein unterscheidet, das phosphorylated (durch die Hinzufügung einer negativ beladenen Gruppe) gewesen ist. Proteine, die getrennt worden sind, können aus dem Gel geschnitten und dann durch die Massenspektrometrie analysiert werden, die das Protein identifiziert.

Beziehen Sie sich bitte auf Bezugsartikel für Beispiele der Anwendung der 2. SDS SEITE.

Medizinische diagnostische Anwendungen

• Der bestätigende HIV-Test verwendet einen Westklecks, um Antihiv-Antikörper in einer menschlichen Serum-Probe zu entdecken. Proteine von bekannten HIV-ANGESTECKTEN Zellen werden getrennt und auf einer Membran als oben befleckt. Dann wird das zu prüfende Serum im primären Antikörper-Inkubationsschritt angewandt; freier Antikörper wird abgewaschen, und ein sekundärer antimenschlicher mit einem Enzym-Signal verbundener Antikörper wird hinzugefügt. Die befleckten Bänder zeigen dann die Proteine an, zu denen das Serum des Patienten Antikörper enthält.
• Ein Westklecks wird auch als der endgültige Test auf Schwerfälligen spongiform encephalopathy (BSE, allgemein gekennzeichnet als 'Krankheit der BSE-kranken Kuh') verwendet.
• Einige Formen der Krankheitsprüfung von Lyme verwenden das Westbeflecken.
• Westklecks kann auch als ein bestätigender Test auf Leberentzündung B Infektion verwendet werden.
• In der Veterinärmedizin wird Westklecks manchmal verwendet, um FIV + Status in Katzen zu bestätigen.

Protokolle

• Westbeflecken-Protokoll von Protocolmonkey
• Modifizierte Westbeflecken-Protokolle von Biotechniques
• Dr Mark Barton Offenherziges Laboratorium-Protokoll
• Das Westbeflecken-Protokoll von Kamps
• http://www.natureprotocols.com/2006/09/15/western_blot_analysis_of_subce.php
• http://www.prosci-inc.com/Western-Blot-Protocol.html
• CSH Protokoll-Sammlung: Immunoblotting
• Westklecks-Protokolle, Fehlerbeseitigung, wissenschaftliche Mittel und Forschungsartikel

Siehe auch

• Weit-Ostklecks
• Das Weit-Westbeflecken
• Das Ostbeflecken
• SDS-SEITIGER

Links

• Das Beflecken Westlich / N/S Anwendungszeichen Neue Veröffentlichungen

Zusammenhängende Verbindungen

• Westklecks-Analyse von fraktionierten Subzellproben mit der Odyssee Infrarotbildaufbereitungssystem (ein Protokoll)
• Westklecks-Protokoll einschließlich Beispiel-Puffer und Wiederuntersuchung des Verfahrens