SDS-SEITIG, Natrium dodecyl Sulfat polyacrylamide Gel-Elektrophorese, beschreibt eine Technik, die weit in der Biochemie, forensics, Genetik und molekularen Biologie verwendet ist, um Proteine gemäß ihrer electrophoretic Beweglichkeit (eine Funktion der Länge einer polypeptide Kette und seiner Anklage) zu trennen. In den meisten Proteinen gibt die Schwergängigkeit von SDS zur polypeptide Kette einen gleichen Vertrieb der Anklage pro Einheitsmasse, dadurch auf einen fractionation durch die ungefähre Größe während der Elektrophorese hinauslaufend.

Verfahren

Beispielvorbereitung

Proben können jedes materielle sein, das Proteine, zum Beispiel prokaryotic oder eukaryotic Zellen, Gewebe, Viren, Umweltproben oder gereinigte Proteine enthält. Im Fall von festen Geweben werden diese häufig zuerst mechanisch mit einem Mixer (für größere Beispielvolumina), mit einem homogenizer (kleinere Volumina), durch sonicator oder durch das Verwenden des Radfahrens des Hochdrucks gebrochen. Zellen können auch durch eine der obengenannten mechanischen Methoden aufgebrochen werden.

Im Fall von Geweben oder Zellen kann eine Kombination von biochemischen und mechanischen Techniken - einschließlich verschiedener Typen des Filtrierens und centrifugation - verwendet werden, um verschiedene Zellabteilungen und organelles vor der Elektrophorese zu trennen.

Die zu analysierende Probe wird mit SDS, ein anionic Reinigungsmittel gemischt, das sekundär und "nicht denaturiert, Disulfid hat" tertiäre Strukturen verbunden, und wendet eine negative Anklage auf jedes Protein im Verhältnis zu seiner Masse an. Die Heizung der Proben zu mindestens 60°C fördert weiter Protein denaturation, SDS helfend, zu binden.

Ein Verfolgen-Färbemittel kann zur Protein-Lösung hinzugefügt werden. Das hat normalerweise eine höhere electrophoretic Beweglichkeit als die Proteine, um dem Experimentator zu erlauben, den Fortschritt der Protein-Lösung durch das Gel während des geführten electrophoretic zu verfolgen.

Vorbereitung acrylamide Gele

Die Gele bestehen normalerweise aus acrylamide, bisacrylamide, SDS und einem Puffer mit einem angepassten pH. Die Lösung kann degassed unter einem Vakuum sein, um die Bildung von Luftbürsten während polymerization zu verhindern.

Eine Quelle von freien Radikalen und einem Ausgleicher wie Ammonium persulfate und TEMED wird hinzugefügt, um polymerization zu beginnen. Die polymerization Reaktion läuft auf ein Gel wegen des zusätzlichen bisacrylamide, allgemein ungefähr 1 Teil in 35 hinsichtlich acrylamide hinaus, der Quer-Verbindungen zwischen zwei polyacrylamide Molekülen bilden kann. Das Verhältnis von acrylamide zu bisacrylamide kann zu speziellen Zwecken geändert werden. Die acrylamide Konzentration des Gels kann auch allgemein in der Reihe von 5 % bis 25 % geändert werden. Niedrigere Prozentsatz-Gele sind dafür besser, sehr hohe Molekulargewicht-Proteine aufzulösen, während viel höhere Prozentsätze erforderlich sind, um kleinere Proteine aufzulösen. Die Bestimmung, wie viel der verschiedenen Lösungen, sich zusammen zu vermischen, um Gele der besonderen acrylamide Konzentration zu machen, möglich ist.

Gele sind gewöhnlich polymerized zwischen zwei Glastellern in einem Gel-Streuer, mit einem Kamm eingefügt oben, um die Beispielbohrlöcher zu schaffen. Nachdem das Gel polymerized ist, kann der Kamm entfernt werden, und das Gel ist zur Elektrophorese bereit.

Elektrophorese

Verschiedene Puffersysteme werden im SDS-SEITIGEN abhängig von der Natur der Probe und des experimentellen Ziels verwendet. Die Puffer, die an der Anode und Kathode verwendet sind, können dasselbe oder verschieden sein.

Ein elektrisches Feld wird über das Gel angewandt, die negativ beladenen Proteine veranlassend, über das Gel zum positiven (+) Elektrode (Anode) abzuwandern. Abhängig von ihrer Größe wird sich jedes Protein verschieden durch die Gel-Matrix bewegen: Kurze Proteine werden leichter durch die Poren im Gel passen, während größere mehr Schwierigkeit haben werden (sie stoßen auf mehr Widerstand). Nach einer Satz-Zeitdauer (gewöhnlich ein paar Stunden - obwohl das von der über das Gel angewandten Stromspannung abhängt; höhere Stromspannungen laufen schneller, aber neigen dazu, etwas schlechtere Entschlossenheit zu erzeugen), die Proteine werden gestützt auf ihrer Größe unterschiedlich abgewandert sein; kleinere Proteine werden weiter unten das Gel gereist sein, während größere näher am Punkt des Ursprungs geblieben sein werden. Proteine können deshalb grob gemäß der Größe (und so Molekulargewicht) getrennt werden; jedoch benehmen sich bestimmte glycoproteins anomal auf SDS Gelen.

Weiter Verarbeitung

Folgende Elektrophorese, das Gel kann (meistens mit Coomassie Brilliant Blauer R-250 oder Silberfleck) befleckt sein, Vergegenwärtigung der getrennten Proteine, oder bearbeitet weiter erlaubend (z.B. Westklecks). Nach der Färbung werden verschiedene Proteine als verschiedene Bänder innerhalb des Gels erscheinen. Es ist üblich, Molekulargewicht-Größe-Anschreiber des bekannten Molekulargewichtes in einer getrennten Gasse im Gel zu führen, um das Gel zu kalibrieren und zu beschließen, dass die ungefähre molekulare Masse von unbekannten Proteinen durch das Vergleichen der Entfernung hinsichtlich des Anschreibers gereist ist.

SDS-SEITIG ist gewöhnlich die erste Wahl als eine Feinprobe der Protein-Reinheit wegen seiner Zuverlässigkeit und Bequemlichkeit. Die Anwesenheit von SDS und dem Denaturieren-Schritt veranlasst Proteine, ungefähr gestützt auf der Größe getrennt zu werden, aber die abweichende Wanderung von einigen Proteinen kann vorkommen. Verschiedene Proteine können auch verschieden Flecken verursachen, der Quantifizierung durch die Färbung stört. SDS-SEITIG kann auch als eine Vorbereitungstechnik für die Reinigung von Proteinen verwendet werden. Zum Beispiel ist quantitative polyacrylamide dauernde heimische (QPNC-SEITIGE) Vorbereitungsgel-Elektrophorese eine Methode, um heimischen metalloproteins in kompliziertem biologischem matrices zu trennen.

Chemische Zutaten und ihre Rollen

Gel von Polyacrylamide (PAG) war als ein potenzielles Einbetten-Medium für sectioning Gewebe schon in 1964 bekannt gewesen, und zwei unabhängige Gruppen haben PAG in der Elektrophorese 1959 verwendet. Es besitzt mehrere electrophoretically wünschenswerte Eigenschaften, die es ein vielseitiges Medium machen. Es ist ein synthetisches, thermostabiles, durchsichtiges, starkes, chemisch relativ träges Gel, und kann mit einer breiten Reihe durchschnittlicher Porengrößen bereit sein. Die Porengröße eines Gels wird durch zwei Faktoren, die Summe der Acrylamide-Gegenwart (%T) (T = Gesamtkonzentration von acrylamide und bisacrylamide monomer) und der Betrag des Quer-Linker (%C) (C = bisacrylamide Konzentration) bestimmt. Porengröße nimmt mit der Erhöhung %T ab; mit der Quer-Verbindung, 5%C gibt die kleinste Porengröße. Jede Zunahme oder Abnahme in %C von 5-%-Zunahmen die Porengröße, weil die Porengröße in Bezug auf %C eine parabolische Funktion mit dem Scheitelpunkt als 5%C ist. Das scheint, wegen der nichthomogenen Bündelung von Polymer-Ufern innerhalb des Gels zu sein. Dieses Gel-Material kann auch Hochspannungsanstiegen widerstehen, ist der verschiedenen Färbung und den destaining Verfahren zugänglich, und kann verdaut, um getrennte Bruchteile herauszuziehen, oder für die Autoröntgenografie und dauerhafte Aufnahme ausgetrocknet werden.

Bestandteile

• Chemischer Puffer Stabilisiert den PH-Wert zum Sollwert innerhalb des Gels selbst und im Elektrophorese-Puffer. Die Wahl des Puffers betrifft auch die electrophoretic Beweglichkeit der Puffergegenionen und dadurch der Entschlossenheit des Gels. Der Puffer sollte auch unreaktiv sein und nicht modifizieren oder mit den meisten Proteinen reagieren. Verschiedene Puffer können als Kathode- und Anode-Puffer beziehungsweise abhängig von der Anwendung verwendet werden. Vielfache PH-Werte können innerhalb eines einzelnen Gels zum Beispiel in der SCHEIBE-Elektrophorese verwendet werden. Allgemeine Puffer im SDS-SEITIGEN schließen Tris, Bis-Tris oder imidazole ein.
• Gegenion-Gleichgewicht die innere Anklage des Pufferions und betrifft auch die elektrische Feldkraft während der Elektrophorese. Hoch beladene und bewegliche Ionen werden häufig in SDS-SEITIGEN Kathode-Puffern vermieden, aber können ins Gel selbst eingeschlossen werden, wo es vor dem Protein abwandert. In Anwendungen wie SDS-SEITIGE SCHEIBE können sich die PH-Werte innerhalb des Gels ändern, um die durchschnittliche Anklage der Gegenionen während des Laufs zu ändern, um Entschlossenheit zu verbessern. Populäre Gegenionen sind glycine und tricine. Glycine ist als die Quelle verwendet worden, Ion oder langsames Ion zu schleppen, weil sein pKa 9.69 ist und Beweglichkeit von glycinate solch sind, dass die wirksame Beweglichkeit an einem Wert unter diesem der langsamsten bekannten Proteine der negativen Nettoanklage in der PH-Reihe gesetzt werden kann. Der minimale pH dieser Reihe ist etwa 8.0. [
• Acrylamide (CHNO; mW: 71.08). Wenn aufgelöst, in Wasser findet langsamer, spontaner autopolymerization von acrylamide statt, sich Molekülen zusammen durch den Kopf auf dem Schwanz Mode anschließend, lange Polymer der einzelnen Kette zu bilden. Die Anwesenheit eines freien radikal erzeugenden Systems beschleunigt außerordentlich polymerization. Diese Art der Reaktion ist als Vinylhinzufügungspolymerisation bekannt. Eine Lösung dieser Polymer-Ketten wird klebrig, aber bildet kein Gel, weil die Ketten einfach über einander gleiten. Gel-Bildung verlangt Verbindung verschiedener Ketten zusammen. Acrylamide ist ein neurotoxin. Es ist auch notwendig, acrylamide in einem kühlen dunklen und trockenen Platz zu versorgen, Autopolymerisation und Hydrolyse zu reduzieren.
• Bisacrylamide (N, N '-Methylenebisacrylamide) (CHNO; mW: 154.17). Bisacrylamide ist das am häufigsten verwendete böse sich verbindende Reagenz für polyacrylamide Gele. Chemisch kann davon als zwei acrylamide Moleküle verbundener Kopf gedacht werden, um an ihren phasenfreien Enden zu gehen. Bisacrylamide kann crosslink zwei polyacrylamide Ketten zu einander, dadurch auf ein Gel hinauslaufend.
• Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) (CHNaOS; mW: 288.38). SDS ist ein starkes reinigendes Reagenz, das verwendet ist, um heimische Proteine zu entfaltetem, individuellem polypeptides zu denaturieren. Wenn eine Protein-Mischung zu 100 °C in die Anwesenheit von SDS, den reinigenden Hüllen um das polypeptide Rückgrat geheizt wird. Es bindet zu polypeptides in einem unveränderlichen Gewicht-Verhältnis von 1.4 g SDS/g polypeptide. In diesem Prozess werden die inneren Anklagen von polypeptides unwesentlich wenn im Vergleich zu den negativen durch SDS beigetragenen Anklagen. So wird Polypeptides-Nachbearbeitung einer Stange ähnliche Strukturen, die eine gleichförmige Anklage-Dichte besitzen, die dieselbe negative Nettoanklage pro Einheitslänge ist. Der electrophoretic mobilities dieser Proteine wird eine geradlinige Funktion der Logarithmen ihrer Molekulargewichte sein.

:Without SDS, verschiedene Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten würden verschieden wegen Unterschiede im Massenanklage-Verhältnis abwandern, weil jedes Protein einen Isoelectric-Punkt und zu seiner primären Struktur besonderes Molekulargewicht hat. Das ist als heimische SEITE bekannt. Beitragender SDS behebt dieses Problem, weil es dazu bindet und das Protein entfaltet, eine fast gleichförmige negative Anklage entlang dem polypeptide gebend.

• Ammonium persulfate (APS) (NHSO; mW: 228.2). APS ist eine Quelle von freien Radikalen und wird häufig als ein Initiator für die Gel-Bildung verwendet. Eine alternative Quelle von freien Radikalen ist Riboflavin, das freie Radikale in einer fotochemischen Reaktion erzeugt hat.
• TEMED (N, N, N', N '-tetramethylethylenediamine) (CHN; mW: 116.21). TEMED stabilisiert freie Radikale und verbessert polymerization. Die Rate der Polymerisation und die Eigenschaften des resultierenden Gels hängen von den Konzentrationen von freien Radikalen ab. Erhöhung des Betrags von freien Radikalen läuft auf eine Abnahme auf die durchschnittliche Polymer-Kettenlänge, eine Zunahme in der Gel-Trübheit und eine Abnahme in der Gel-Elastizität hinaus. Das Verringern des Betrags zeigt die Rückwirkung. Die niedrigsten katalytischen Konzentrationen, die Polymerisation in einer angemessenen Zeitspanne erlauben werden, sollten verwendet werden. APS und TEMED werden normalerweise bei ungefähr äquimolaren Konzentrationen im Rahmen 1 bis 10 Mm verwendet.

Chemikalien für die Verarbeitung und Vergegenwärtigung

Die folgenden Chemikalien werden verwendet, um vom Gel und den darin vergegenwärtigten Protein-Proben in einer Prozession zu gehen:

• Das Verfolgen des Färbemittels. Da Proteine größtenteils farblos sind, kann ihrem Fortschritt durch das Gel während der Elektrophorese nicht leicht gefolgt werden. Färbemittel von Anionic einer bekannten electrophoretic Beweglichkeit werden deshalb gewöhnlich in den SDS-SEITIGEN Beispielpuffer eingeschlossen. Ein sehr allgemeines Verfolgen-Färbemittel ist Bromophenol blau (BPB, 3', 3", 5', 5" tetrabromophenolsulfonphthalein). Dieses Färbemittel wird an Alkali und neutralem pH gefärbt und ist ein kleines negativ beladenes Molekül, das an die Anode herangeht. Wenn es ein hoch bewegliches Molekül ist, bewegt es sich vor den meisten Proteinen. Da es reicht, wird das anodic Ende der Elektrophorese-Medium-Elektrophorese angehalten. Es kann zu einigen Proteinen schwach binden und eine blaue Farbe geben.
• Das Laden der Hilfe. Die meisten SDS-SEITIGEN Systeme werden von der Spitze in Bohrlöcher innerhalb des Gels geladen. Sicherzustellen, dass das Beispielbecken zum Boden des Gels, Beispielpuffer mit Zusätzen ergänzt wird, die die Dichte der Probe vergrößern. Diese Zusätze sollten nichtionisch und zu Proteinen phasenfrei sein, um zu vermeiden, Elektrophorese zu stören. Allgemeine Zusätze sind Glyzerin und Rohrzucker.
• Coomassie Brilliant Blauer R-250 (CBB) (CHNNaOS; mW: 825.97). CBB ist der populärste Protein-Fleck. Es ist ein Anionic-Färbemittel, das nichtspezifisch zu Proteinen bindet. Die Struktur von CBB ist vorherrschend nichtpolar, und es wird gewöhnlich in der methanolic mit essigsaurer Säure angesäuerten Lösung verwendet. Proteine im Gel werden durch essigsaure Säure befestigt und gleichzeitig befleckt. Das ins Gel vereinigte Überfärbemittel kann durch destaining mit derselben Lösung ohne das Färbemittel entfernt werden. Die Proteine werden als blaue Bänder auf einem klaren Hintergrund entdeckt. Da SDS auch anionic ist, kann er Färbeprozess stören. Deshalb wird das große Volumen der Färbelösung, mindestens zehnmal das Volumen des Gels empfohlen.

DAS SDS-SEITIGE Reduzieren

Außer der Hinzufügung von SDS können Proteine zum nahen Kochen in Gegenwart von einem abnehmenden Agenten, wie dithiothreitol (DTT) oder 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol/BME) fakultativ kurz geheizt werden, der weiter die Proteine durch das Reduzieren von Disulfid-Verbindungen, so die Überwindung einiger Formen der tertiären Protein-Falte denaturiert, und Vierergruppe-Protein-Struktur (oligomeric Subeinheiten) zerbrechend. Das ist als das Reduzieren SDS-SEITIG bekannt, und wird meistens verwendet.

Silberfärbung

Im 14. Jahrhundert wurde die Silberfärbetechnik entwickelt, für die Oberfläche des Glases zu färben. Es ist umfassend für diesen Zweck seit dem verwendet worden

Das 16. Jahrhundert. Die durch die frühen Silberflecke erzeugte Farbe hat sich zwischen dem Hellgelb und einem orangeroten erstreckt. Camillo Golgi hat die Silberfärbung für die Studie des Nervensystems vervollkommnet. Die Methode von Golgi beschmutzt eine begrenzte Zahl von Zellen aufs Geratewohl in ihrer Gesamtheit. Der genaue chemische Mechanismus, durch den das geschieht, ist noch größtenteils unbekannt. Silberfärbung wurde von Kerenyi und Gallyas als ein empfindliches Verfahren eingeführt, um Spur-Beträge von Proteinen in Gelen zu entdecken. Die Technik ist zur Studie anderer biologischer Makromoleküle erweitert worden, die in einer Vielfalt von Unterstützungen getrennt worden sind. Klassischer Coomassie Brilliant Blaue Färbung kann gewöhnlich ein 50 ng Protein-Band, Silberfärbezunahmen die Empfindlichkeit normalerweise 50mal entdecken. Viele Variablen können die Farbtiefe beeinflussen, und jedes Protein hat seine eigenen Färbeeigenschaften; sauberes Glas, reine Reagenzien und Wasser der höchsten Reinheit sind die Stichpunkte zur erfolgreichen Färbung.

Puffersysteme

Die meisten Protein-Trennungen werden mit einem "diskontinuierlichen" (oder SCHEIBE) Puffersystem durchgeführt, das bedeutsam die Schärfe der Bänder innerhalb des Gels erhöht. Während der Elektrophorese in einem diskontinuierlichen Gel-System wird ein Ion-Anstieg in der frühen Bühne der Elektrophorese gebildet, die alle Proteine veranlasst, sich in ein einzelnes scharfes Band zu konzentrieren. Die Bildung des Ion-Anstiegs wird durch die Auswahl eines PH-Werts erreicht, an dem die Ionen des Puffers nur im Vergleich zu den SDS-gekleideten Proteinen gemäßigt beladen werden. Diese Bedingungen stellen eine Umgebung zur Verfügung, in der Reaktionen von Kohlrausch das Mahlzahn-Leitvermögen bestimmen. Infolgedessen werden SDS-gekleidete Proteine zu mehrerer Falte in einer dünnen Zone der Ordnung von 19 μm innerhalb von ein paar Minuten konzentriert. In dieser Bühne wandern alle Proteine mit derselben Wanderungsgeschwindigkeit durch isotachophoresis ab. Das kommt in einem Gebiet des Gels vor, das größere Poren hat, so dass die Gel-Matrix die Wanderung während der Fokussierung oder "des Stapelns" des Ereignisses nicht verzögert. Die Trennung der Proteine durch die Größe wird in tiefer erreicht, Gebiet des Gels "auflösend". Der Agarose-Gel hat normalerweise eine viel kleinere Porengröße, die zu einer siebenden Wirkung führt, die jetzt die electrophoretic Beweglichkeit der Proteine bestimmt. Zur gleichen Zeit hat der sich trennende Teil des Gels auch einen PH-Wert, in dem die Pufferionen durchschnittlich eine größere Anklage tragen, sie veranlassend, die SDS-bedeckten Proteine "zu entkommen" und den Ion-Anstieg und dadurch die Stapeln-Wirkung zu beseitigen.

Ein sehr weit verbreitetes diskontinuierliches Puffersystem ist der tris-glycine oder "das Laemmli" System, das an einem pH 6.8 aufschobert und sich an einem pH ~8.3-9.0 auflöst. Ein Nachteil dieses Systems besteht darin, dass diese PH-Werte Disulfid-Band-Bildung zwischen cysteine Rückständen in den Proteinen fördern können, weil sich der pKa von cysteine von 8-9 erstreckt, und weil das Reduzieren der Reagenz-Gegenwart im ladenden Puffer nicht co-migrate mit den Proteinen tut. Neue Fortschritte in der Pufferung der Technologie erleichtern dieses Problem durch die Auflösung der Proteine an einem pH ganz unter dem pKa von cysteine (z.B, bis-tris, pH 6.5) und schließen abnehmende Reagenzien ein (z.B Natrium bisulfite), die ins Gel vor den Proteinen umziehen, um eine abnehmende Umgebung aufrechtzuerhalten. Ein zusätzlicher Vorteil, Puffer mit niedrigeren PH-Werten zu verwenden, ist, dass das acrylamide Gel stabilere niedrigere PH-Werte ist, so können die Gele seit langen Zeitspannen vor dem Gebrauch versorgt werden.

SDS Anstieg-Gel-Elektrophorese von Proteinen

Da Stromspannung, die Anionen angewandt wird (und negativ gestürmt hat, Beispielmoleküle) wandern zur positiven Elektrode (Anode) im niedrigeren Raum ab, das Hauption ist Kl. ¯ (hohe Beweglichkeit und hohe Konzentration); glycinate ist das schleifende Ion (niedrige Beweglichkeit und niedrige Konzentration). SDS-Protein-Partikeln wandern frei an der Grenze zwischen der Kl. ¯ des Gel-Puffers und Gly ¯ des Kathode-Puffers nicht ab. Friedrich Kohlrausch hat gefunden, dass das Gesetz des Ohms auch für aufgelöste Elektrolyte gilt. Wegen des Spannungsabfalls zwischen der Kl. - und den Glycine-Puffern werden Proteine (aufgeschobert) ins Mikrometer dünne Schichten zusammengepresst. Die Grenzbewegungen durch einen Porenanstieg und den Protein-Stapel zerstreuen sich allmählich wegen einer Reibungswiderstand-Zunahme der Gel-Matrix. Das Stapeln und Unstapeln kommen unaufhörlich im Anstieg-Gel für jedes Protein an einer verschiedenen Position vor. Weil ein ganzes Protein, das die Polyacrylamide-Gel-Konzentration unaufschobert, um 16 % T zu weit gehen muss. Das Zwei-Gele-System von "Laemmli" ist ein einfaches Anstieg-Gel. Die PH-Diskontinuität der Puffer ist keiner Bedeutung für die Trennungsqualität, und ein "Stapeln-Gel" mit einem verschiedenen pH ist nicht erforderlich.

Siehe auch

• Kapillare Elektrophorese
• DNA-Elektrophorese
• Das Ostbeflecken
• Electroblotting
• Elektrophorese
• Gel-Elektrophorese
• Geschichte der Elektrophorese
• Isoelectric, der sich konzentriert
• Isotachophoresis
• Heimische Gel-Elektrophorese
• Das nördliche Beflecken
• Protein-Elektrophorese
• Das südliche Beflecken
• Zwei dimensionale SDS-SEITIGE
• Das Westbeflecken
• Zymography

Links

• Demystifying SDS-SEITIGES Video
• Demystifying SDS-SEITIGER
• SDS-SEITIGE Rechenmaschine für kundengerecht angefertigte Rezepte für TRIS Harnstoff-Gele.
• 2-dimensionales Protein Gelelectrophoresis
• http://www.biomalpar.org/updatedMethods_In_Malaria_Research_5thedition.pdf Hempelmann E. SDS-Protein PAGE und Proteindetection durch Silverstaining und Immunoblotting von Proteinen von Plasmodium falciparum. in: Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (Hrsg.) Methoden in der Sumpffieber-Forschung, 5. Ausgabe, 2008, 263-266