In der molekularen Biologie ist Beschränkungsbruchstück-Länge polymorphism oder RFLP (allgemein ausgesprochene "Rif-Lippe"), eine Technik, die Schwankungen in homologen DNA-Folgen ausnutzt. Es bezieht sich auf einen Unterschied zwischen Proben von homologen DNA-Molekülen, die aus sich unterscheidenden Positionen von Beschränkungsenzym-Seiten, und zu einer zusammenhängenden Labortechnik kommen, durch die diese Segmente illustriert werden können. In der RFLP Analyse wird die DNA-Probe (verdaut) durch Beschränkungsenzyme zerbrochen, und die resultierenden Beschränkungsbruchstücke werden gemäß ihren Längen durch die Gel-Elektrophorese getrennt. Obwohl jetzt größtenteils veraltet wegen des Anstiegs der billigen DNA sequencing Technologien RFLP Analyse die erste DNA-Technik der im Profil darstellte war, die billig genug ist, um weit verbreitete Anwendung zu sehen. Zusätzlich zum genetischen Fingerabdruck war RFLP ein wichtiges Werkzeug im Genom kartografisch darstellend, Lokalisierung von Genen für genetische Unordnungen, Entschluss von der Gefahr für Krankheit und Vaterschaft-Prüfung.

Analyse-Technik

Die grundlegende Technik, um RFLPs zu entdecken, ist mit dem Brechen einer Probe der DNA durch ein Beschränkungsenzym verbunden, das anerkennen und DNA schneiden kann, wo auch immer eine spezifische kurze Folge in einem als eine Beschränkungsauswahl bekannten Prozess vorkommt. Die resultierenden DNA-Bruchstücke werden dann durch die Länge durch einen Prozess bekannt als agarose Gel-Elektrophorese getrennt, und einer Membran über das Südliche Klecks-Verfahren übertragen. Die Kreuzung der Membran zu einer etikettierten DNA-Untersuchung bestimmt dann die Länge der Bruchstücke, die zur Untersuchung ergänzend sind. Ein RFLP kommt vor, wenn sich die Länge eines entdeckten Bruchstücks zwischen Personen ändert. Jede Bruchstück-Länge wird als ein Allel betrachtet, und kann in der genetischen Analyse verwendet werden.

RFLP Analyse kann in die Single - (SLP) und Paradigmen der Untersuchung des mehrgeometrischen Orts (MLP) unterteilt werden. Gewöhnlich wird die SLP Methode über MLP bevorzugt, weil es empfindlicher, leichter ist zu dolmetschen und fähig dazu, Proben der MISCH-DNA zu analysieren. Außerdem können Daten erzeugt werden, selbst wenn die DNA erniedrigt wird (z.B, wenn es im Knochen gefunden wird, bleibt.)

Beispiele

Es gibt zwei allgemeine Mechanismen, durch die sich die Größe eines besonderen Beschränkungsbruchstücks ändern kann. Jungah und Carrolee sind das erste schematische, ein kleines Segment des Genoms wird durch eine DNA-Untersuchung (dickere Linie) entdeckt. Im Allel "A" wird das Genom durch ein Beschränkungsenzym an drei nahe gelegenen Seiten (Dreiecke) zerspaltet, aber nur das niedrigstwertige Bruchstück wird durch die Untersuchung entdeckt. Im Allel "a" ist Beschränkungsseite 2 durch eine Veränderung verloren worden, so entdeckt die Untersuchung jetzt das größere verschmolzene Bruchstück, das von Seiten 1 bis 3 läuft. Das zweite Diagramm zeigt, wie diese Bruchstück-Größe-Schwankung einen Südlichen Klecks betrachten würde, und wie jedes Allel (zwei pro Person) in Mitgliedern einer Familie geerbt werden könnte.

Im dritten schematischen werden die Untersuchung und das Beschränkungsenzym gewählt, um ein Gebiet des Genoms zu entdecken, das ein VNTR variables Segment (Kästen) einschließt. Im Allel "c" gibt es fünf Wiederholungen im VNTR, und die Untersuchung entdeckt ein längeres Bruchstück zwischen den zwei Beschränkungsseiten. Im Allel "d" gibt es nur zwei Wiederholungen im VNTR, so entdeckt die Untersuchung ein kürzeres Bruchstück zwischen denselben zwei Beschränkungsseiten. Andere genetische Prozesse, wie Einfügungen, Auswischen, Versetzungen, und Inversionen, können auch zu RFLPs führen.

Anwendungen

Die Analyse der RFLP Schwankung in Genomen war ein Lebenswerkzeug im Genom kartografisch darstellende und genetische Krankheitsanalyse. Wenn Forscher versuchen würden, die chromosomale Position eines besonderen Krankheitsgens am Anfang zu bestimmen, würden sie die DNA von Mitgliedern einer Familie analysieren, die durch die Krankheit gequält ist, und nach RFLP Allelen suchen, die ein ähnliches Muster des Erbes als diese der Krankheit zeigen (sieh Genetische Verbindung). Sobald ein Krankheitsgen lokalisiert wurde, konnte die RFLP Analyse anderer Familien offenbaren, wer gefährdet für die Krankheit war, oder wer wahrscheinlich ein Transportunternehmen der Mutationsgene sein konnte.

RFLP Analyse war auch die Basis für frühe Methoden des Genetischen Fingerabdrucks, der in der Identifizierung von Proben nützlich ist, die von Tatorten, im Entschluss von der Vaterschaft, und in der Charakterisierung der genetischen Ungleichheit oder Fortpflanzung von Mustern in Tierbevölkerungen wiederbekommen sind.

Alternativen

Die Technik für die RFLP Analyse ist jedoch, langsam und beschwerlich. Es verlangt einen großen Betrag der Beispiel-DNA und den vereinigten Prozess von Untersuchungsbeschriften, DNA-Zersplitterung, Elektrophorese, Beflecken, Kreuzung, Wäsche, und Autoröntgenografie konnte bis zu einen Monat nehmen, um zu vollenden. Eine beschränkte Version der RFLP Methode, die Oligonucleotide-Untersuchungen verwendet hat, wurde 1985 berichtet. Glücklich haben die Ergebnisse des Humangenomprojekts das Bedürfnis nach RFLP kartografisch darstellend größtenteils ersetzt, und die Identifizierung von vielen einzelnen-nucleotide polymorphisms (SNPs) in diesem Projekt (sowie die direkte Identifizierung von vielen Krankheitsgenen und Veränderungen) hat das Bedürfnis nach der RFLP Krankheitsverbindungsanalyse ersetzt (sieh SNP genotyping). Die Analyse von VNTR Allelen geht weiter, aber wird jetzt gewöhnlich durch Methoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Zum Beispiel schließen die Standardprotokolle für den DNA-Fingerabdruck PCR Analyse von Tafeln von mehr als einem Dutzend VNTRs ein.

RFLP ist noch eine in der geholfenen Auswahl des Anschreibers verwendete Technik. Endbeschränkungsbruchstück-Länge polymorphism (TRFLP oder manchmal T-RFLP) ist eine molekulare Biologie-Technik, die am Anfang entwickelt ist, um Bakteriengemeinschaften in Mischart-Proben zu charakterisieren. Die Technik ist auch auf andere Gruppen einschließlich Boden-Fungi angewandt worden.

TRFLP arbeitet durch die PCR Erweiterung der DNA mit Zündvorrichtungspaaren, die mit Leuchtstoffanhängseln etikettiert worden sind. Die PCR Produkte werden dann mit RFLP Enzymen verdaut, und die resultierenden Muster haben sich das Verwenden einer DNA-Ablaufsteuerung vergegenwärtigt. Die Ergebnisse werden entweder durch das einfache Zählen und das Vergleichen von Bändern oder Spitzen im TRFLP Profil, oder durch das Zusammenbringen von Bändern von einem oder mehr TRFLP-Läufen bis eine Datenbank bekannter Arten analysiert. Die Technik ist in einigen Aspekten DGGE oder TGGE ähnlich.

Die mit einem RFLP direkt beteiligten Folge-Änderungen können auch schneller durch PCR analysiert werden. Erweiterung kann über die veränderte Beschränkungsseite und die mit dem Beschränkungsenzym verdauten Produkte geleitet werden. Diese Methode ist Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) genannt worden. Wechselweise kann das verstärkte Segment durch Untersuchungen des Allels Spezifischen Oligonucleotide (ASO), einen Prozess analysiert werden, der häufig durch einen einfachen Klecks von Dot getan werden kann.

Siehe auch

• STR Analyse
• AFLP

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