Das grüne Leuchtstoffprotein (GFP) ist ein Protein, das aus 238 Aminosäure-Rückständen (26.9kDa) zusammengesetzt ist, der hellgrüne Fluoreszenz, wenn ausgestellt, ausstellt, sich im Blau zur ultravioletten Reihe zu entzünden. Obwohl viele andere Seeorganismen ähnliche grüne Leuchtstoffproteine haben, bezieht sich GFP traditionell auf das Protein, das zuerst von der Qualle Aequorea Viktoria isoliert ist. Der GFP von A. Viktoria hat eine Haupterregungsspitze an einer Wellenlänge von 395 nm und einem geringen an 475 nm. Seine Emissionsspitze ist an 509 nm, der im niedrigeren grünen Teil des sichtbaren Spektrums ist. Der Quant-Fluoreszenz-Ertrag (QY) von GFP ist 0.79. Der GFP vom Seestiefmütterchen (Renilla reniformis) hat eine einzelne Haupterregungsspitze an 498 nm.

In der Zelle und molekularen Biologie wird das GFP Gen oft als ein Reporter des Ausdrucks verwendet. In modifizierten Formen ist es verwendet worden, um biosensors zu machen, und viele Tiere sind geschaffen worden, dass ausdrücklicher GFP als ein Beweis des Konzepts, dass ein Gen überall in einem gegebenen Organismus ausgedrückt werden kann. Das GFP Gen kann in Organismen eingeführt und in ihrem Genom durch die Fortpflanzung, Einspritzung mit einem Virenvektoren oder Zelltransformation aufrechterhalten werden. Bis heute ist das GFP Gen eingeführt und in vielen Bakterien, Hefe und anderen Fungi, Fisch (wie zebrafish), Werk, Fliege und Säugetierzellen einschließlich des Menschen ausgedrückt worden. Martin Chalfie, Osamu Shimomura und Roger Y. Tsien wurden dem 2008-Nobelpreis in der Chemie am 10. Oktober 2008 für ihre Entdeckung und Entwicklung des grünen Leuchtstoffproteins zuerkannt.

Geschichte

Wilder Typ GFP (wtGFP)

In den 1960er Jahren und 1970er Jahren wurde GFP, zusammen mit dem getrennten lumineszierenden Protein aequorin, zuerst von Aequorea Viktoria und seine von Osamu Shimomura studierten Eigenschaften gereinigt. In A. Viktoria kommt GFP Fluoreszenz vor, wenn aequorin mit Ionen von Ca aufeinander wirkt, ein blaues Glühen veranlassend. Etwas von dieser lumineszierenden Energie wird dem GFP übertragen, die gesamte Farbe zum Grün auswechselnd. Jedoch hat sein Dienstprogramm als ein Werkzeug für Molekularbiologen nicht begonnen, bis 1992 begriffen zu werden, als Douglas Prasher das Klonen und die nucleotide Folge von wtGFP in Gene gemeldet hat. Die Finanzierung für dieses Projekt war ausgegangen, so hat Prasher cDNA Proben an mehrere Laboratorien gesandt. Das Laboratorium von Martin Chalfie hat die Codierfolge von wtGFP, mit den ersten paar Aminosäuren gelöscht, in heterologous Zellen von E. coli und C. elegans ausgedrückt, die Ergebnisse in der Wissenschaft 1994 veröffentlichend. Das Laboratorium von Frederick Tsuji hat unabhängig den Ausdruck des recombinant Proteins einen Monat später gemeldet. Bemerkenswert hat sich das GFP Molekül gefaltet und war bei der Raumtemperatur, ohne das Bedürfnis nach exogenous cofactors spezifisch zur Qualle Leuchtstoff-. Obwohl diese Nähe - wtGFP Leuchtstoff-war, hatte sie mehrere Nachteile, einschließlich kulminierter Doppelerregungsspektren, PH-Empfindlichkeit, Chlorid-Empfindlichkeit, schlechten Fluoreszenz-Quant-Ertrags, schlechter Photostabilität und schlechter Falte an 37°C.

Die erste berichtete Kristallstruktur eines GFP war die des S65T Mutanten durch die Gruppe von Remington in der Wissenschaft 1996. Einen Monat später hat die Gruppe von Phillips unabhängig den wilden Typ GFP Struktur in der Natur Biotech gemeldet. Diese Kristallstrukturen haben Lebenshintergrund auf der chromophore Bildung und den benachbarten Rückstand-Wechselwirkungen zur Verfügung gestellt. Forscher haben diese Rückstände durch geleiteten und zufälligen mutagenesis modifiziert, um das große Angebot an GFP Ableitungen im Gebrauch heute zu erzeugen. Martin Chalfie, Osamu Shimomura und Roger Y. Tsien teilen den 2008-Nobelpreis in der Chemie für ihre Entdeckung und Entwicklung des grünen Leuchtstoffproteins.

GFP Ableitungen

Wegen des Potenzials für den weit verbreiteten Gebrauch und die sich entwickelnden Bedürfnisse nach Forschern sind viele verschiedene Mutanten von GFP konstruiert worden. Die erste Hauptverbesserung war eine einzelne Punkt-Veränderung (S65T) hat 1995 in der Natur durch Roger Tsien berichtet. Diese Veränderung hat drastisch die geisterhaften Eigenschaften von GFP verbessert, auf vergrößerte Fluoreszenz, Photostabilität und eine Verschiebung der Haupterregungsspitze zu 488 nm mit der an 509 nm behaltenen Maximalemission hinauslaufend. Das hat die geisterhaften Eigenschaften allgemein verfügbarer FITC Filtersätze verglichen, die Nützlichkeit des Gebrauches durch den allgemeinen Forscher vergrößernd. 37 °C sich faltende Leistungsfähigkeit (F64L) spitzt Mutanten auf dieses tragende Schafott an, haben GFP (EGFP) erhöht wurde 1995 vom Laboratorium von Ole Thastrup entdeckt. EGFP hat den praktischen Gebrauch von GFPs in Säugetierzellen erlaubt. EGFP hat einen Erlöschen-Koeffizienten (hat ε angezeigt) 55,000 Mcm. Der Quant-Fluoreszenz-Ertrag (QY) von EGFP ist 0.60. Die Verhältnishelligkeit, ausgedrückt als ε\· QY, ist 33,000 Mcm.

Supermappe GFP, eine Reihe von Veränderungen, die GFP erlauben, sich schnell zu falten und reif zu werden, selbst wenn verschmolzen zur schwachen Falte peptides, wurde 2006 berichtet.

Viele andere Veränderungen sind einschließlich Farbenmutanten gemacht worden; insbesondere blaues Leuchtstoffprotein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), zyanes Leuchtstoffprotein (ECFP, Himmelblau, CyPet), und gelbe Leuchtstoffprotein-Ableitungen (YFP, Citrin, Venus, YPet). BFP Ableitungen (außer mKalama1) enthalten den Y66H Ersatz. Die kritische Veränderung in zyanen Ableitungen ist der Y66W Ersatz, der den chromophore veranlasst, sich mit einem indole aber nicht Phenol-Bestandteil zu formen. Mehrere zusätzliche ausgleichende Veränderungen im Umgebungsbarrel sind erforderlich, Helligkeit dazu wieder herzustellen, hat chromophore wegen des vergrößerten Hauptteils der indole Gruppe modifiziert. Die rot ausgewechselte Wellenlänge der YFP Ableitungen wird durch die T203Y Veränderung vollbracht und ist wegen π-Electron-Stapeln-Wechselwirkungen zwischen dem eingesetzten tyrosine Rückstand und dem chromophore. Diese zwei Klassen von geisterhaften Varianten werden häufig für Experimente der Klangfülle-Energieübertragung von Förster (FRET) verwendet. Genetisch verschlüsselte VERÄRGERUNGS-Reporter, die zur Zelle Signalmoleküle, wie Kalzium oder glutamate, Protein phosphorylation Staat, Protein-Fertigstellung, Empfänger dimerization und andere Prozesse empfindlich sind, stellen hoch spezifische optische Ausgaben der Zelltätigkeit in Realtime zur Verfügung.

Halbvernünftiger mutagenesis mehrerer Rückstände hat zu mit dem pH empfindlichen Mutanten bekannt als pHluorins, und späterer superekliptischer pHluorins geführt. Durch die Ausnutzung der schnellen Änderung im pH auf synaptic vesicle Fusion, pHluorins markiert zu synaptobrevin sind verwendet worden, um sich synaptic Tätigkeit in Neuronen zu vergegenwärtigen.

Redox empfindliche Versionen von GFP (roGFP) wurden durch die Einführung von cysteines in die Beta-Barrelstruktur konstruiert. Der redox Staat des cysteines bestimmt die Leuchtstoffeigenschaften von roGFP.

Die Nomenklatur von modifiziertem GFPs ist häufig wegen der Überschneidung kartografisch darstellend von mehreren GFP Versionen auf einen einzelnen Namen verwirrend. Zum Beispiel, mGFP bezieht sich häufig auf einen GFP mit einem N-Terminal palmitoylation, der den GFP veranlasst, zu Zellmembranen zu binden. Jedoch wird derselbe Begriff auch gebraucht, um sich auf monomeric GFP zu beziehen, der häufig durch die Dimer-Schnittstelle erreicht wird, die A206K Veränderung bricht. Wilder Typ GFP hat eine schwache dimerization Tendenz bei Konzentrationen über 5 mg/mL. mGFP auch tritt "für modifizierten GFP ein," der durch den Aminosäure-Austausch für den stabilen Ausdruck in Pflanzenzellen optimiert worden ist.

Struktur

GFP hat eine typische Beta-Barrelstruktur, das Bestehen aus einem β-sheet mit der Alpha-Spirale (N), die den covalently enthält, hat chromophore 4-(p-hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-one (HBI) das Durchbohren des Zentrums verpfändet. HBI ist ohne das richtig gefaltete GFP Schafott Nichtleuchtstoff- und besteht hauptsächlich in der gewerkschaftlich organisierten Phenol-Form in wtGFP. Nach innen liegende Seitenketten des Barrels veranlassen spezifische cyclization Reaktionen im tripeptide Ser65-Tyr66-Gly67, die Ionisation von HBI zur Phenolate-Form und chromophore Bildung veranlassen. Dieser Prozess der Postübersetzungsmodifizierung wird Reifung genannt. Das wasserstoffverpfändende Netz und die elektronaufschobernden Wechselwirkungen mit diesen Seitenketten beeinflussen die Farbe, Intensität und Photostabilität von GFP und seinen zahlreichen Ableitungen. Die dicht gepackte Natur des Barrels schließt lösende Moleküle aus, die chromophore Fluoreszenz davor schützend, durch Wasser zu löschen.

Verwenden

Die Verfügbarkeit von GFP und seinen Ableitungen hat Fluoreszenz-Mikroskopie und die Weise gründlich wiederdefiniert, wie es in der Zellbiologie und den anderen biologischen Disziplinen verwendet wird. Während kleinste Leuchtstoffmoleküle wie FITC (fluorescein isothiocyanate), wenn verwendet, in lebenden Zellen stark phototoxisch sind, sind Leuchtstoffproteine wie GFP gewöhnlich, wenn illuminiert, in lebenden Zellen viel weniger schädlich. Das hat die Entwicklung hoch automatisierter Fluoreszenz-Mikroskopie-Systeme der lebenden Zelle ausgelöst, die verwendet werden können, um Zellen zu beobachten, die mit der Zeit ein oder mehr mit Leuchtstoffproteinen markierte Proteine ausdrücken. Zum Beispiel war GFP im Beschriften der Spermatozoiden von verschiedenen Organismen zu Identifizierungszwecken als in der Taufliege melanogaster weit verwendet worden, wo der Ausdruck von GFP als ein Anschreiber für eine besondere Eigenschaft verwendet werden kann. GFP kann auch in verschiedenen Strukturen ausgedrückt werden, die morphologische Unterscheidung ermöglichen. In solchen Fällen wird das Gen für die Produktion von GFP ins Genom des Organismus im Gebiet der DNA gesplissen, die für die Zielproteine codiert und das von derselben Durchführungsfolge kontrolliert wird; d. h. die Durchführungsfolge des Gens kontrolliert jetzt die Produktion von GFP zusätzlich zum markierten Protein (En). In Zellen, wo das Gen, und die markierten Proteine ausgedrückt wird, werden erzeugt, GFP wird zur gleichen Zeit erzeugt. So werden nur jene Zellen, in denen das markierte Gen, oder die Zielproteine ausgedrückt wird, erzeugt, wird fluoresce, wenn beobachtet, unter der Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Analyse solchen Zeitraffer-Kinos hat das Verstehen von vielen biologischen Prozessen einschließlich der Protein-Falte, des Protein-Transports und der RNS-Dynamik wiederdefiniert, die in der Vergangenheit mit befestigt (d. h., tot) Material studiert worden war. Erhaltene Daten werden auch verwendet, um mathematische Modelle von intrazellulären Systemen zu kalibrieren und Raten des Genausdrucks zu schätzen.

Der Vertico SMI Mikroskop mit dem SPDM Phymod Technologie verwendet die so genannte "umkehrbare Photobleiche" Wirkung von Leuchtstofffärbemitteln wie GFP und seine Ableitungen, um sie als einzelne Moleküle in einer optischen Entschlossenheit von 10 nm zu lokalisieren. Das kann auch als eine Co-Lokalisierung von zwei GFP Ableitungen (2CLM) durchgeführt werden.

Ein anderer starker Gebrauch von GFP soll das Protein in kleinen Sätzen von spezifischen Zellen ausdrücken. Das erlaubt Forschern, spezifische Typen von Zellen in vitro (in einem Teller), oder sogar in vivo (im lebenden Organismus) optisch zu entdecken. Genetisch das Kombinieren mehrerer geisterhafter Varianten von GFP ist ein nützlicher Trick für die Analyse des Gehirnschaltsystemes (Brainbow). Anderer interessanter Gebrauch von Leuchtstoffproteinen in der Literatur schließt das Verwenden FPs als Sensoren des Neuron-Membranenpotenzials, das Verfolgen von AMPA Empfängern auf Zellmembranen, Virenzugang und der Infektion von individuellen Grippe-Viren und lentiviral Viren usw. ein.

Es ist auch gefunden worden, dass neue Linien von transgenic GFP Ratten für die Gentherapie sowie verbessernde Medizin wichtig sein können. Durch das Verwenden "hohen-expresser" GFP, transgenic Ratten zeigen hohen Ausdruck in den meisten Geweben und vielen Zellen, die nicht charakterisiert worden sind oder nur in vorherigen GFP-transgenic Ratten schlecht charakterisiert worden sind. Durch seine Fähigkeit, inneren chromophore zu bilden, ohne zusätzlichen cofactors, Enzyme oder Substrate außer molekularem Sauerstoff zu verlangen, macht GFP für ein ausgezeichnetes Werkzeug in allen Formen der Biologie.

gezeigt hat, ist GFP in der Kryobiologie als eine Lebensfähigkeitsfeinprobe nützlich gewesen. Die Korrelation der Lebensfähigkeit, wie gemessen, durch trypan blaue Feinproben war 0.97.

Ein neuartiger möglicher Gebrauch von GFP schließt das Verwenden davon als ein empfindlicher Monitor von intrazellulären Prozessen über ein eGFP aus einer menschlichen embryonischen Nierezelllinie gemachtes Lasersystem ein. Der erste konstruierte lebende Laser wird durch einen eGFP das Ausdrücken der Zelle innerhalb einer reflektierenden optischen Höhle und des Schlagens davon mit Pulsen des blauen Lichtes gemacht. An einer bestimmten Pulsschwelle wird die optische Produktion des eGFP heller und völlig gleichförmig in der Farbe des reinen Grüns mit einer Wellenlänge von 516 nm. Bevor es als Laserlicht ausgestrahlt wird, drängt das Licht hin und her innerhalb der Resonator-Höhle und Pässe die Zelle zahlreiche Zeiten. Indem sie die Änderungen in der optischen Tätigkeit studieren, können Forscher Zellprozesse besser verstehen.

GFP in der Natur

Der Zweck sowohl von bioluminescence als auch von GFP Fluoreszenz in der Qualle ist unbekannt. GFP ist co-expressed mit aequorin in kleinen Körnchen um den Rand der Qualle-Glocke. Die sekundäre Erregungsspitze (480 nm) GFP absorbiert wirklich etwas von der blauen Emission von aequorin, dem bioluminescence einen grüneren Farbton gebend. Der serine 65 Rückstand des GFP chromophore ist für die doppelkulminierten Erregungsspektren des wilden Typs GFP verantwortlich. Es wird in allen drei GFP isoforms ursprünglich geklont von Prasher erhalten. Fast alle Veränderungen dieses Rückstands konsolidieren die Erregungsspektren zu einer einzelnen Spitze entweder an 395 nm oder an 480 nm. Der genaue Mechanismus dieser Empfindlichkeit ist kompliziert, aber es scheint, schließt Spende eines Wasserstoffs von serine 65 zu glutamate 222 ein, der chromophore Ionisation beeinflusst. Da eine einzelne Veränderung die 480 nm Erregungsspitze drastisch erhöhen kann, GFP einen viel effizienteren Partner von aequorin, A machend. Viktoria scheint, weniger - effizientes, doppelkulminiertes Erregungsspektrum evolutionär zu bevorzugen. Roger Tsien hat nachgesonnen, dass das Verändern hydrostatischen Drucks mit der Tiefe die Fähigkeit von serine 65 betreffen kann, einen Wasserstoff dem chromophore zu schenken und das Verhältnis der zwei Erregungsspitzen auszuwechseln. So kann die Qualle die Farbe seines bioluminescence mit der Tiefe ändern. Jedoch hat ein Zusammenbruch in der Bevölkerung der Qualle im Freitagshafen, wo GFP ursprünglich entdeckt wurde, weitere Studie der Rolle von GFP in der natürlichen Umgebung der Qualle behindert.

GFP in der feinen Kunst

Julian Voss-Andreae, ein Künstler deutschen Ursprungs, der sich auf "Protein-Skulpturen spezialisiert," hat Skulpturen geschaffen, die auf der Struktur von GFP, einschließlich der 5'6" (1.70 m) hohes "Grünes Leuchtstoffprotein" (2004) und die 4'7" (1.40 m) hohe "Stahlqualle" (2006) gestützt sind. Die letzte Skulptur wird am Platz der Entdeckung von GFP von Shimomura 1962, der Universität Washingtons am Freitag Hafen-Laboratorien gelegen.

Haustiere von Transgenic

Alba, ein Grün-Leuchtstoffkaninchen, wurde von einem französischen Laboratorium geschaffen, das von Eduardo Kac beauftragt ist, der GFP zum Zwecke des sozialen und Kunstkommentars verwendet. Die US-Firmenmärkte von Yorktown Technologies zu Aquarium-Geschäften grüner Leuchtstoffzebrafish (GloFish), die am Anfang entwickelt wurden, um Verschmutzung in Wasserstraßen zu entdecken. NeonPets, die Vereinigten Staaten haben Firmenmärkte grüne Leuchtstoffmäuse zur Lieblingsindustrie als NeonMice gestützt. Grüne Leuchtstoffschweine, bekannt als Noels, wurden von einer Gruppe von Forschern gezüchtet, die von Wu Shinn-Chih an der Abteilung der Tierwissenschaft und Technologie an der Nationalen Universität von Taiwan geführt sind. Eine japanisch-amerikanische Mannschaft hat Grün-Leuchtstoffkatzen als Beweis des Konzepts geschaffen, um sie potenziell als Musterorganismen für Krankheiten, besonders HIV zu verwenden.

Siehe auch

• pGLO
• Gelbes Leuchtstoffprotein

Weiterführende Literatur

• Populäres Wissenschaftsbuch, das Geschichte und Entdeckung von GFP beschreibt

Links

• GFP Antikörper http://www.rockland-inc.com/gfp.aspx
• Ein umfassender Artikel über Leuchtstoffproteine an Scholarpedia
• Kurze Zusammenfassung von GFP merklichen Papieren
• Das interaktive Java applet das Demonstrieren der Chemie hinter der Bildung des GFP chromophore
• Video des 2008-Nobelpreis-Vortrags von Roger Tsien auf Leuchtstoffproteinen
• Erregung und Emissionsspektren für verschiedene Leuchtstoffproteine
• Grünes Leuchtstoffprotein Chem Soc Hochwürdiger unter einem bestimmten Thema stehendes Problem, das den 2008-Nobelpreisträgern in der Chemie, Professoren Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Y. Tsien gewidmet ist