Chromatographie des Größe-Ausschlusses (SEC) ist eine chromatographic Methode, in der Moleküle in der Lösung durch ihre Größe, und in einigen Fällen Molekulargewicht getrennt werden. Es wird gewöhnlich auf große Moleküle oder makromolekulare Komplexe wie Proteine und Industriepolymer angewandt. Gewöhnlich, wenn eine wässrige Lösung verwendet wird, um die Probe durch die Säule zu transportieren, ist die Technik als Chromatographie des Gel-Filtrierens, gegen den Namen Gel-Durchdringungschromatographie bekannt, die verwendet wird, wenn ein organisches Lösungsmittel als eine bewegliche Phase verwendet wird. SEC ist eine weit verwendete Polymer-Charakterisierungsmethode wegen seiner Fähigkeit, guten Mahlzahn-Massenvertrieb (Mw) Ergebnisse für Polymer zur Verfügung zu stellen.

Anwendungen

Die Hauptanwendung der Chromatographie des Gel-Filtrierens ist der fractionation von Proteinen und anderen wasserlöslichen Polymern, während Gel-Durchdringungschromatographie verwendet wird, um den Molekulargewicht-Vertrieb von organisch-auflösbaren Polymern zu analysieren. Entweder Technik sollte mit der Gel-Elektrophorese nicht verwirrt sein, wo ein elektrisches Feld verwendet wird, um Moleküle durch das Gel abhängig von ihren elektrischen Anklagen "zu ziehen" oder "zu stoßen".

Vorteile

Die Vorteile dieser Methode schließen gute Trennung von großen Molekülen von den kleinen Molekülen mit einem minimalen Volumen von eluate ein, und dass verschiedene Lösungen angewandt werden können, ohne den Filtrieren-Prozess, alle zu stören, während man die biologische Tätigkeit der zu trennenden Partikeln bewahrt. Die Technik wird allgemein mit anderen dass weiter getrennte Moleküle durch andere Eigenschaften, wie Säure, Basizität, Anklage und Sympathie für bestimmte Zusammensetzungen verbunden. Mit der Größe-Ausschluss-Chromatographie gibt es kurze und bestimmte Trennungszeiten und schmale Bänder, die zu guter Empfindlichkeit führen. Es gibt auch keinen Beispielverlust, weil solutes mit der stationären Phase nicht aufeinander wirken. Nachteile sind zum Beispiel, dass nur eine begrenzte Zahl von Bändern angepasst werden kann, weil der zeitliche Rahmen des Chromatogramms, und im Allgemeinen kurz ist, muss es einen 10-%-Unterschied in der molekularen Masse geben, um eine gute Entschlossenheit zu haben

Entdeckung

Die Technik wurde von Grant Henry Lathe und Colin R Ruthven erfunden, im Krankenhaus von Königin Charlotte, London arbeitend. Sie haben später den Preis von John Scott für diese Erfindung erhalten. Während Lathe und Ruthven Stärke-Gele als die Matrix verwendet haben, hat Jerker Porath und Pro Flodin später dextran Gele eingeführt; andere Gele mit der Größe fractionation Eigenschaften schließen agarose und polyacrylamide ein. Eine kurze Rezension dieser Entwicklungen ist erschienen.

Es gab auch Versuche, synthetische hohe Polymer zu fraktionieren; jedoch, erst als 1964, als J. C. Moore von Dow Chemical Company seine Arbeit an der Vorbereitung von Säulen von Gel Permeation Chromatography (GPC) veröffentlicht hat, die auf dem quer-verbundenen Polystyrol mit der kontrollierten Porengröße gestützt sind, dass eine Eskalation der Forschungstätigkeit in diesem Feld begonnen hat. Es wurde fast sofort anerkannt, dass mit der richtigen Kalibrierung GPC fähig war, um Mahlzahn-Masse und Mahlzahn-Massenvertriebsinformation für synthetische Polymer zur Verfügung zu stellen. Weil die letzte Information schwierig war, durch andere Methoden vorzuherrschen, ist GPC schnell in den umfassenden Gebrauch gekommen.

Theorie und Methode

Eine Voraussetzung für SEC ist, dass der analyte mit der Oberfläche der stationären Phasen nicht aufeinander wirkt. Unterschiede in der elution Zeit basieren allein auf dem Volumen, das der analyte "sieht". So "sieht" ein kleines Molekül, das in jede Ecke des Porensystems der stationären Phase eindringen kann, das komplette Porenvolumen und das Zwischenpartikel-Volumen, und wird elute spät (als die Pore - und Zwischenpartikel-Volumen die Säule ~80 % des Säulenvolumens durchgeführt hat). Auf dem anderen Extrem "sieht" ein sehr großes Molekül, das ins Porensystem nicht eindringen kann, nur das Zwischenpartikel-Volumen (~35 % des Säulenvolumens), und wird elute früher, als dieses Volumen der beweglichen Phase die Säule durchgeführt hat. Der zu Grunde liegende Grundsatz von SEC ist, dass Partikeln verschiedener Größen elute (Filter) durch eine stationäre Phase an verschiedenen Raten werden. Das läuft auf die Trennung einer Lösung von auf der Größe gestützten Partikeln hinaus. Vorausgesetzt, dass alle Partikeln gleichzeitig oder nahe gleichzeitig geladen werden, sollten Partikeln derselben Größe elute zusammen.

Jedoch, da es verschiedenes Maß der Größe eines Makromoleküls gibt (zum Beispiel, der Radius der Kreisbewegung und der hydrodynamische Radius), ist ein grundsätzliches Problem in der Theorie von SEC die Wahl eines richtigen molekularen Größe-Parameters gewesen, durch den Moleküle von verschiedenen Arten getrennt werden. Experimentell haben Benoit und Mitarbeiter eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem elution Volumen und einer dynamisch basierten molekularen Größe, dem hydrodynamischen Volumen, für mehrere verschiedene Kettenarchitektur und chemische Zusammensetzungen gefunden. Die beobachtete auf dem hydrodynamischen Volumen gestützte Korrelation ist akzeptiert als die Basis der universalen SEC Kalibrierung geworden.

Und doch, der Gebrauch des hydrodynamischen Volumens, eine Größe, die auf dynamischen Eigenschaften in der Interpretation von SEC Daten gestützt ist, wird nicht völlig verstanden. Das ist, weil SEC normalerweise unter niedrigen Durchfluss-Bedingungen geführt wird, wo hydrodynamischer Faktor wenig Wirkung auf die Trennung haben sollte. Tatsächlich nehmen sowohl Theorie als auch Computersimulationen einen thermodynamischen Trennungsgrundsatz an: Der Trennungsprozess wird durch die Gleichgewichtsverteilung (das Verteilen) von solute Makromolekülen zwischen zwei Phasen---eine verdünnte Hauptteil-Lösungsphase bestimmt, die am zwischenräumlichen Raum und den beschränkten Lösungsphasen innerhalb der Poren der Säule gelegen ist, die Material einpackt. Gestützt auf dieser Theorie ist es gezeigt worden, dass der relevante Größe-Parameter zum Verteilen von Polymern in Poren die Mittelspanne-Dimension ist (haben Sie maximalen Vorsprung auf eine Linie vor). Obwohl dieses Problem nicht völlig aufgelöst worden ist, ist es wahrscheinlich, dass die Mittelspanne-Dimension und das hydrodynamische Volumen stark aufeinander bezogen werden.

Jede Größe-Ausschluss-Säule hat eine Reihe von Molekulargewichten, die getrennt werden können. Die Ausschluss-Grenze definiert das Molekulargewicht am oberen Ende dieser Reihe und ist, wo Moleküle zu groß sind, um in der stationären Phase gefangen zu werden. Die Durchdringungsgrenze definiert das Molekulargewicht am niedrigeren Ende der Reihe der Trennung und ist, wohin Moleküle einer genug kleinen Größe in die Poren der stationären Phase völlig eindringen können und alle Moleküle unter dieser molekularen Masse dass sie elute als ein einzelnes Band so klein

Das wird gewöhnlich mit einem Apparat genannt eine Säule erreicht, die aus einer hohlen Tube besteht, die dicht mit äußerst kleinen porösen Polymer-Perlen gepackt ist, die entworfen sind, um Poren verschiedener Größen zu haben. Diese Poren können Depressionen auf der Oberfläche oder den Kanälen durch die Perle sein. Da die Lösung unten die Säule reist, treten einige Partikeln in die Poren ein. Größere Partikeln können als viele Poren nicht eintreten. Je größer die Partikeln, desto schneller der elution.

Die gefilterte Lösung, die am Ende gesammelt wird, ist als der eluate bekannt. Das leere Volumen schließt irgendwelche Partikeln ein, die zu groß sind, um ins Medium einzugehen, und das lösende Volumen ist als das Säulenvolumen bekannt.

Faktoren, die Filtrieren betreffen

In wahren Situationen haben Partikeln in der Lösung keine feste Größe, auf die Wahrscheinlichkeit hinauslaufend, dass eine Partikel, die durch eine Pore vorübergehendes Recht dadurch sonst behindert würde. Außerdem werden die stationär-phasigen Partikeln nicht ideal definiert; sowohl Partikeln als auch Poren können sich in der Größe ändern. Kurven von Elution ähneln deshalb Vertrieb von Gaussian. Die stationäre Phase kann auch auf unerwünschte Weisen mit einer Partikel aufeinander wirken und Aufbewahrungsfristen beeinflussen, obwohl große Sorge von Säulenherstellern genommen wird, um stationäre Phasen zu verwenden, die träge sind und dieses Problem minimieren.

Wie andere Formen der Chromatographie, die Säulenlänge vergrößernd, wird die Entschlossenheit erhöhen, und Erhöhung des Säulendiameters vergrößert die Kapazität der Säule. Richtige Säulenverpackung ist wichtig, um Entschlossenheit zu maximieren: Eine übergepackte Säule kann die Poren in den Perlen zusammenbrechen, auf einen Verlust der Entschlossenheit hinauslaufend. Eine underpacked Säule kann die Verhältnisfläche der stationären für kleinere Arten zugänglichen Phase reduzieren, auf jene Arten hinauslaufend, die weniger in Poren gefangene Zeit verbringen. Verschieden von Affinitätschromatographie-Techniken kann ein lösender Kopf an der Oberseite von der Säule Entschlossenheit drastisch verringern, weil sich die Probe vor dem Laden verbreitet, den abwärts gelegenen elution verbreiternd.

Analyse

In einfachen manuellen Säulen wird der Eluent in unveränderlichen Volumina gesammelt, die als Bruchteile bekannt sind. Das ähnlichere die Partikeln sind in der Größe wahrscheinlicher, werden sie in demselben Bruchteil und nicht entdeckt getrennt sein. Fortgeschrittenere Säulen überwinden dieses Problem durch die unveränderliche Überwachung des Eluenten.

Die gesammelten Bruchteile werden häufig durch spektroskopische Techniken untersucht, um die Konzentration der Partikeln eluted zu bestimmen. Allgemeine Spektroskopie-Entdeckungstechniken sind Brechungsindex (RI) und ultraviolett (UV). Wenn eluting spektroskopisch ähnliche Arten (solcher als während der biologischen Reinigung), andere Techniken notwendig sein können, um den Inhalt jedes Bruchteils zu identifizieren. Es ist auch möglich, den Eluent-Fluss unaufhörlich mit RI, LALLS, Mehrwinkellaserlicht zu analysieren, das MALS, UV und/oder Viskositätsmaße Streut.

Das elution Volumen (Ve) nimmt grob geradlinig mit dem Logarithmus des molekularen hydrodynamischen Volumens ab. Säulen werden häufig mit 4-5 Standardproben (z.B, gefaltete Proteine des bekannten Molekulargewichtes), und einer Probe kalibriert, die ein sehr großes Molekül wie thyroglobulin enthält, um das leere Volumen zu bestimmen. (Blauer dextran wird für den Entschluss von Vo nicht empfohlen, weil es heterogen ist und variable Ergebnisse geben kann), werden Die elution Volumina der Standards durch das elution Volumen des thyroglobulin (Ve/Vo) geteilt und gegen den Klotz der Molekulargewichte der Standards geplant.

Anwendungen

Biochemische Anwendungen

Im Allgemeinen wird SEC eine niedrige Entschlossenheitschromatographie betrachtet, weil er ähnliche Arten sehr gut nicht wahrnimmt, und deshalb häufig für den "glänzend werdenden" Endschritt einer Reinigung vorbestellt wird. Die Technik kann die Vierergruppe-Struktur von gereinigten Proteinen bestimmen, die langsame Austauschzeiten haben, da es unter heimischen Lösungsbedingungen ausgeführt werden kann, makromolekulare Wechselwirkungen bewahrend. SEC kann auch Protein tertiäre Struktur prüfen, weil es das hydrodynamische Volumen (nicht Molekulargewicht) misst, gefalteten und entfalteten Versionen desselben Proteins erlaubend, bemerkenswert zu sein. Zum Beispiel könnte der offenbare hydrodynamische Radius eines typischen Protein-Gebiets 14 Å und 36 Å für die gefalteten und entfalteten Formen beziehungsweise sein. SEC erlaubt die Trennung dieser zwei Formen, weil die gefaltete Form elute viel später wegen seiner kleineren Größe wird.

Polymer-Synthese

SEC kann als ein Maß sowohl der Größe als auch des Polydisperses eines aufgebauten Polymers, d. h. die Fähigkeit verwendet werden im Stande zu sein, den Vertrieb der Größen von Polymer-Molekülen zu finden. Wenn Standards einer bekannten Größe vorher geführt werden, dann kann eine Eichkurve geschaffen werden, um die Größen von Polymer-Molekülen von Interesse im Lösungsmittel zu bestimmen, das für die Analyse (häufig THF) gewählt ist. Auf die alternative Mode können Techniken wie das leichte Zerstreuen und/oder viscometry online mit SEC verwendet werden, um absolute Molekulargewichte nachzugeben, die sich auf die Kalibrierung mit Standards des bekannten Molekulargewichtes nicht verlassen. Wegen des Unterschieds in der Größe von zwei Polymern mit identischen Molekulargewichten sind die absoluten Entschluss-Methoden im Allgemeinen, wünschenswerter. Ein typisches SEC System kann schnell (in ungefähr einer halben Stunde) geben Polymer-Chemiker-Information über die Größe und den Polydispers der Probe. Der vorbereitende SEC kann für das Polymer fractionation auf einer analytischen Skala verwendet werden.

Nachteil

In SEC wird Masse so viel als das hydrodynamische Volumen der Polymer-Moleküle nicht gemessen, d. h. wie viel Raum ein besonderes Polymer-Molekül aufnimmt, wenn es in der Lösung ist. Jedoch kann das ungefähre Molekulargewicht von SEC Daten berechnet werden, weil die genaue Beziehung zwischen Molekulargewicht und hydrodynamischem Volumen für das Polystyrol gefunden werden kann. Dafür wird Polystyrol als ein Standard verwendet. Aber die Beziehung zwischen hydrodynamischem Volumen und Molekulargewicht ist nicht dasselbe für alle Polymer, so nur ein ungefähre Maß kann erhalten werden.

Ein anderer Nachteil ist die Möglichkeit der Wechselwirkung zwischen der stationären Phase und dem analyte. Jede Wechselwirkung führt zu einer späteren elution Zeit und ahmt so eine kleinere analyte Größe nach.

Absolute Chromatographie des Größe-Ausschlusses

Absolute Chromatographie des Größe-Ausschlusses (ASEC) ist eine Technik, die ein Instrument des dynamischen leichten Zerstreuens (DLS) zu einem Größe-Ausschluss-Chromatographie-System für absolute Größe-Maße von Proteinen und Makromolekülen als sie elute vom Chromatographie-System verbindet.

Die Definition des Absoluten verwendet hier ist, dass es nicht verlangt, dass Kalibrierung hydrodynamische Größe, häufig gekennzeichnet als hydrodynamisches Diameter (D in Einheiten von nm) erhält. Die Größen der Makromoleküle werden als sie elute in die Fluss-Zelle des DLS Instrumentes vom Größe-Ausschluss-Säulensatz gemessen. Es sollte bemerkt werden, dass die hydrodynamische Größe der Moleküle oder Partikeln gemessen wird und nicht ihre Molekulargewichte. Für Proteine kann ein Typ Mark-Houwink der Berechnung verwendet werden, um das Molekulargewicht von der hydrodynamischen Größe zu schätzen.

Ein großer Vorteil von mit SEC verbundenem DLS ist die Fähigkeit, erhöhte DLS Entschlossenheit zu erhalten. Gruppe ist DLS schnell und einfach und stellt ein direktes Maß der durchschnittlichen Größe zur Verfügung, aber die Grundlinie-Entschlossenheit von DLS ist 3 bis 1 im Durchmesser. Mit SEC werden die Proteine und das Protein oligomers getrennt, oligomeric Entschlossenheit erlaubend. Ansammlungsstudien können auch mit ASEC getan werden, obwohl die gesamte Konzentration nicht berechnet werden darf, wird die Größe der Anhäufung nur gemessen, um durch die maximale Größe eluting aus den SEC Säulen beschränkt zu werden.

Beschränkungen von ASEC schließen Durchfluss, Konzentration und Präzision ein. Weil eine Korrelationsfunktion überall von 3-7 Sekunden verlangt, um richtig zu bauen, kann eine begrenzte Zahl von Datenpunkten über die Spitze gesammelt werden.

Siehe auch

• PEGylation