Electroporation oder electropermeabilization, ist eine bedeutende Zunahme im elektrischen Leitvermögen und der Durchdringbarkeit der durch ein äußerlich angewandtes elektrisches Feld verursachten Zellplasmamembran. Es wird gewöhnlich in der molekularen Biologie als eine Weise verwendet, eine Substanz in eine Zelle, wie das Laden davon mit einer molekularen Untersuchung, ein Rauschgift einzuführen, das die Funktion der Zelle oder ein Stück ändern kann, DNA zu codieren.

Electroporation ist ein dynamisches Phänomen, das von der lokalen transmembrane Stromspannung an jedem Punkt auf der Zellmembran abhängt. Es wird allgemein akzeptiert, dass für eine gegebene Pulsdauer und Gestalt eine spezifische transmembrane Stromspannungsschwelle für die Manifestation des electroporation Phänomenes (von 0.5 V zu 1 V) besteht. Das führt zur Definition einer elektrischen Feldumfang-Schwelle für electroporation (E). D. h. nur die Zellen innerhalb von Gebieten, wo EE electroporated sind. Wenn eine zweite Schwelle (E) erreicht oder übertroffen wird, wird electroporation die Lebensfähigkeit der Zellen, d. h., irreversibler electroporation in Verlegenheit bringen.

In der molekularen Biologie wird der Prozess von electroporation häufig für die Transformation von Bakterien, Hefe und Werk protoplasts verwendet. Zusätzlich zu den lipid Membranen haben Bakterien auch Zellwände, die von den lipid Membranen verschieden sind und aus peptidoglycan und seinen Ableitungen gemacht werden. Jedoch sind die Wände natürlich porös und handeln nur als steife Schalen, die Bakterien vor strengen Umwelteinflüssen schützen. Wenn Bakterien und plasmids zusammen gemischt werden, kann der plasmids in die Zelle danach electroporation übertragen werden. Mehrere hundert Volt über eine Entfernung von mehreren Millimetern werden normalerweise in diesem Prozess verwendet. Später müssen die Zellen sorgfältig behandelt werden, bis sie eine Chance gehabt haben, erzeugende neue Zellen zu teilen, die wieder hervorgebrachten plasmids enthalten. Dieser Prozess ist etwa zehnmal so wirksam wie chemische Transformation.

Dieses Verfahren ist auch für die Einführung von Auslandsgenen in Gewebekulturzellen, besonders Säugetierzellen hoch effizient. Zum Beispiel wird es im Prozess verwendet, Knock-Out-Mäuse, sowie in der Geschwulst-Behandlung, Gentherapie und zellbasierten Therapie zu erzeugen. Der Prozess, Auslands-DNA in eukaryotic Zellen einzuführen, ist als transfection bekannt.

Laborpraxis

Electroporation wird mit electroporators, Geräte getan, die ein elektromagnetisches Feld in der Zelllösung schaffen. Die Zellsuspendierung ist pipetted in ein Glas oder Plastik cuvette, der zwei Aluminiumelektroden auf seinen Seiten hat.

Für bakteriellen electroporation normalerweise wird eine Suspendierung von ungefähr 50 Mikrolitern verwendet. Vor electroporation wird es mit dem umzugestaltenden plasmid gemischt. Die Mischung ist pipetted in den cuvette, die Stromspannung und Kapazität werden gesetzt, und der cuvette wird in den electroporator eingefügt. Sofort danach electroporation wird der ein Milliliter des flüssigen Mediums zu den Bakterien (im cuvette oder in einer eppendorf Tube) hinzugefügt, und die Tube wird bei der optimalen Temperatur der Bakterien seit einer Stunde ausgebrütet oder mehr Wiederherstellung der Zellen und Ausdruck des antibiotischen Widerstands zu erlauben, der durch das Verbreiten auf Agar-Tellern gefolgt ist.

Der Erfolg des elecroporation hängt außerordentlich von der Reinheit der plasmid Lösung besonders auf seinem Salz-Inhalt ab. Lösungen mit hohen Salz-Konzentrationen könnten eine elektrische Entladung verursachen (bekannt als das Funken), der häufig die Lebensfähigkeit der Bakterien reduziert.

Für eine weitere ausführliche Untersuchung des Prozesses sollte mehr Aufmerksamkeit dem Produktionsscheinwiderstand des porator Geräts und dem Eingangsscheinwiderstand der Zellsuspendierung (z.B Salz-Inhalt) geschenkt werden. Da der Prozess direkten elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden und der Suspendierung braucht, und mit isolierten Elektroden inoperabel ist, offensichtlich ist der Prozess mit bestimmten elektrolytischen Effekten, wegen kleiner Ströme und nicht nur Felder verbunden.

Electroporators

Electroporators kommen in zwei Typen: tragbar und Bank-Spitzen. Benchtop electroporators werden allgemein als allgemeine Laboratorium-Ausrüstung verwendet, oben auf einer Hauptbank oder Motorhaube wohnend. Sie bieten den Vorteil von electroporating vielfachen Proben zur gleichen Zeit an. Sie können auch auf verschiedene Betriebsrahmen je nachdem gesetzt werden, ob die Zelle eine Zellwand hat. Im Gegensatz sind tragbare electroporators drahtlos, wiederaufladbar und verwenden verfügbare pipectrodes, die Elemente sowohl von cuvettes als auch von Pipetten verbinden. Ihre Betriebsrahmen werden zu den optimalen Rahmen voreingestellt, um entweder Bakterien oder Säugetierzellen umzugestalten.

Beide Typen von electoporators sind auf einer breiten Reihe von Zellen - einschließlich E. coli (für die Transformation) und Säugetierzellen wie Neurone, astrocytes, neuroglia, Lymphozyten, monocytes, fibroblasts, epithelische und endothelial Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten und Affen (für transfection) verwendet worden.

Medizinische Anwendungen

fand, hat eine höhere Stromspannung von electroporation in Schweinen Zielzellen innerhalb einer schmalen Reihe irreversibel zerstört, während sie benachbarte Zellen ungekünstelt verlassen hat, und vertritt so eine viel versprechende neue Behandlung für Krebs, Herzkrankheit und andere Krankheitsstaaten, die Eliminierung des Gewebes verlangen.

Eine neue Technik hat gerufen nichtthermischer irreversibler electroporation (N-REIFEN) hat sich erfolgreich im Behandeln vieler verschiedener Typen von Geschwülsten und anderem unerwünschtem Gewebe erwiesen. Dieses Verfahren wird mit kleinen Elektroden (ungefähr 1 Mm im Durchmesser), gelegt entweder innen getan oder das Zielgewebe umgebend, um kurze, wiederholende Ausbrüche von Elektrizität an einer vorher bestimmten Stromspannung und Frequenz anzuwenden. Diese Ausbrüche von Elektrizität vergrößern die Ruhe transmembrane Potenzial (TMP), so dass sich nanopores in der Plasmamembran formen. Wenn die auf das Gewebe angewandte Elektrizität über der elektrischen Feldschwelle des Zielgewebes ist, werden die Zellen dauerhaft durchlässig von der Bildung von nanopores. Infolgedessen sind die Zellen unfähig, den Schaden zu ersetzen und wegen eines Verlustes von homeostasis zu sterben. N-REIFEN ist zu anderer Geschwulst ablation Techniken einzigartig, in denen es Thermalschaden am Gewebe darum nicht schafft.

Contrastingly, umkehrbarer electroporation kommt vor, wenn die mit den Elektroden angewandte Elektrizität unter der elektrischen Feldschwelle des Zielgewebes ist. Weil die angewandte Elektrizität unter der Schwelle der Zellen ist, erlaubt sie den Zellen, ihren phospholipid bilayer zu reparieren und mit ihren normalen Zellfunktionen fortzusetzen. Umkehrbarer electroporation wird normalerweise mit Behandlungen getan, die mit dem Bekommen eines Rauschgifts oder Gens verbunden sind (oder anderes Molekül, das für die Zellmembran nicht normalerweise durchlässig ist) in die Zelle. Nicht das ganze Gewebe hat dieselbe elektrische Feldschwelle; deshalb müssen sorgfältige Berechnungen vor einer Behandlung gemacht werden, Sicherheit und Wirkung zu sichern.

Ein Hauptvorteil, N-REIFEN zu verwenden, besteht darin, dass, wenn getan, richtig gemäß sorgfältigen Berechnungen, er nur das Zielgewebe betrifft. Proteine, die extracellular Matrix und kritischen Strukturen wie Geäder und Nerven sind alle ungekünstelt und linke gesund durch diese Behandlung. Das berücksichtigt eine schnellere Wiederherstellung, und erleichtert einen schnelleren Ersatz von toten Geschwulst-Zellen mit gesunden Zellen.

Die erste erfolgreiche Behandlung von bösartigen Hautgeschwülsten implanted in Mäusen wurde 2007 von einer Gruppe von Wissenschaftlern vollendet, die ganze Geschwulst ablation in 12 aus 13 Mäusen erreicht haben. Sie haben das durch zum Senden von 80 Pulsen von 100 Mikrosekunden an 0.3Hz mit einem elektrischen Feldumfang von 2500 V/cm vollbracht, um die Hautgeschwülste zu behandeln.

Vor dem Tun des Verfahrens müssen Wissenschaftler genau sorgfältig berechnen, welche Bedürfnisse, getan zu werden, und jeden Patienten auf einer Basis des Einzelfalls durch den Fall behandeln. Um zu tun wird das, Technologie wie CT-Ansehen und MRI'S darstellend, allgemein verwendet, um ein 3D-Image der Geschwulst zu schaffen. Von dieser Information können sie dem Volumen der Geschwulst näher kommen und sich für den besten Kurs der Handlung einschließlich der Einfügungsseite von Elektroden, des Winkels entscheiden sie werden in, die Stromspannung erforderlich, und mehr mit der Softwaretechnologie eingefügt. Häufig wird eine CT Maschine verwendet, um mit dem Stellen von Elektroden während des Verfahrens besonders zu helfen, wenn die Elektroden verwendet werden, um Geschwülste im Gehirn zu behandeln.

Das komplette Verfahren ist sehr schnell, normalerweise ungefähr fünf Minuten nehmend. Die Erfolg-Rate dieser Verfahren ist hoch und ist für die zukünftige Behandlung in Menschen sehr viel versprechend. Ein Nachteil zum Verwenden des N-REIFENS ist, dass die von den Elektroden befreite Elektrizität Muskelzellen stimulieren kann, um sich zusammenzuziehen, der tödliche Folgen abhängig von der Situation haben konnte. Deshalb muss ein paralytisches Reagenz verwendet werden, wenn man das Verfahren durchführt. Die paralytischen Agenten, die in solcher Forschung verwendet worden sind, sind erfolgreich; jedoch gibt es immer eine Gefahr, obgleich gering, wenn es Narkosemittel verwendet.

Eine neuere Technik ist genannt irreversiblen Hochfrequenzelectroporation (H-FEUER) entwickelt worden. Diese Technik verwendet Elektroden, um bipolar Ausbrüche von Elektrizität an einer hohen Frequenz, im Vergleich mit einpoligen Ausbrüchen von Elektrizität an einer niedrigen Frequenz anzuwenden. Dieser Typ des Verfahrens hat dieselbe Geschwulst ablation Erfolg wie N-REIFEN. Jedoch hat es einen verschiedenen Vorteil, H-FEUER verursacht Muskelzusammenziehung im Patienten nicht, und deshalb gibt es kein Bedürfnis nach einem paralytischen Agenten.

Wissenschaftler haben hohe Erfolg-Raten in behandelnden Laboratorium-Tieren mit vielen verschiedenen Arten von Geschwülsten gehabt. Obwohl Wissenschaftler nicht bereit sind, irreversiblen electroporation alltäglich zu verwenden, um komplizierte Geschwülste in Menschen zu behandeln, wird N-REIFEN in Menschen allgemeiner verwendet, um einfache subkutane oder Hautgeschwülste zu behandeln. Zusätzlich zum Behandeln subkutaner und Hautgeschwülste hat es Versuche des Verwendens dieser Technologie gegeben, um Vorsteherdrüse, Lunge, Niere und Leber-Krebs in Menschen zu behandeln. Jedoch sind Wissenschaftler noch im Prozess, diese Technologie und seinen zu verstehen, auf Tieren und Menschen betroffen. Eine von Kenneth Thompson getane Studie u. a. geprüft die Sicherheit des N-REIFENS auf Menschen, die unter der Lunge, der Niere oder den Leber-Geschwülsten leiden. Der 69 behandelten Geschwülste haben 49 von ihnen ganze Geschwulst ablation erreicht. Die erfolgreichste Behandlungsrate ist in Leber-Geschwülsten vorgekommen. Diese Studie stellt ermutigende Beweise für die Zukunft des Gebrauches des N-REIFENS als eine Methode zur Verfügung, Krebs in Menschen zu behandeln.

Electroporation kann auch verwendet werden, um zu helfen, Rauschgifte oder Gene in die Zelle durch die Verwendung kurzer und intensiver elektrischer Pulse dass vergänglich permeabilize Zellmembran zu liefern, so Transport von durch eine Zellmembran sonst nicht transportierten Molekülen erlaubend. Dieses Verfahren wird electrochemotherapy genannt, wenn die zu transportierenden Moleküle ein chemotherapeutic Agent oder Gen electrotransfer sind, wenn das zu transportierende Molekül DNA ist.

Physischer Mechanismus

Electroporation erlaubt Zelleinführung von großen hoch beladenen Molekülen wie DNA, die sich über den hydrophoben bilayer Kern nie passiv verbreiten würde. Dieses Phänomen zeigt an, dass der Mechanismus die Entwicklung der Nm-Skala wassergefüllte Löcher in der Membran ist. Obwohl electroporation und dielektrische Depression beides Ergebnis von Anwendung eines elektrischen Feldes, die beteiligten Mechanismen im Wesentlichen verschieden sind. In der dielektrischen Depression wird das Barriere-Material ionisiert, einen leitenden Pfad schaffend. Die materielle Modifizierung ist so in der Natur chemisch. Im Gegensatz während electroporation werden die lipid Moleküle nicht chemisch verändert, aber wechseln einfach Position aus, eine Pore öffnend, die als der leitende Pfad durch den bilayer handelt, weil es mit Wasser gefüllt wird.

Electroporation ist ein Mehrschritt-Prozess mit mehreren verschiedenen Phasen. Erstens muss ein kurzer elektrischer Puls angewandt werden. Typische Rahmen würden 300-400 mV für &lt sein; 1 Millisekunde über die Membran (Zeichen - die in Zellexperimenten verwendeten Stromspannungen sind normalerweise viel größer, weil sie über große Entfernungen zur Hauptteil-Lösung so das resultierende Feld über die wirkliche Membran angewandt werden, ist nur ein kleine Bruchteil der angewandten Neigung). Laut der Anwendung dieses Potenzials stürmt die Membran wie ein Kondensator durch die Wanderung von Ionen von der Umgebungslösung. Sobald das kritische Feld erreicht wird, gibt es eine schnelle lokalisierte Neuordnung in der lipid Morphologie. Wie man glaubt, ist die resultierende Struktur eine "Vorpore", da es nicht elektrisch leitend ist, aber schnell zur Entwicklung einer leitenden Pore führt. Beweise für die Existenz solcher Vorporen kommen größtenteils aus dem "Flackern" von Poren, das einen Übergang zwischen leitenden und isolierenden Staaten andeutet. Es ist darauf hingewiesen worden, dass diese Vorporen (~3 Å) hydrophobe Defekte klein sind. Wenn diese Theorie richtig ist, dann konnte der Übergang zu einem leitenden Staat durch eine Neuordnung am Porenrand erklärt werden, in dem sich die Lipid-Köpfe falten, um eine wasserquellfähige Schnittstelle zu schaffen. Schließlich können diese leitenden Poren entweder heilen, den bilayer wiedersiegelnd, oder sich ausbreiten, schließlich ihn brechend. Das resultierende Schicksal hängt ab, ob die kritische Defekt-Größe überschritten wurde, der der Reihe nach vom angewandten Feld, der lokalen mechanischen Betonung und der bilayer Rand-Energie abhängt.