Antikörper von Monoclonal (mAb oder moAb) sind monospezifische Antikörper, die dasselbe sind, weil sie durch identische geschützte Zellen gemacht werden, die alle Klone einer einzigartigen Elternteilzelle sind. Antikörper von Monoclonal haben monovalent Sympathie, darin binden sie zu demselben epitope.

In Anbetracht fast jeder Substanz ist es möglich, monoclonal Antikörper zu erzeugen, die spezifisch zu dieser Substanz binden; sie können dann dienen, um diese Substanz zu entdecken oder zu reinigen. Das ist ein wichtiges Werkzeug in der Biochemie, molekularen Biologie und Medizin geworden. Wenn verwendet, als Medikamente, die Nichteigentumsrauschgift-Namenenden in - mab (sieh "Nomenklatur von monoclonal Antikörpern").

Entdeckung

Die Idee von einer "magischen Kugel" wurde zuerst von Paul Ehrlich vorgeschlagen, der, am Anfang des 20. Jahrhunderts, verlangt hat, dass, wenn eine Zusammensetzung dieser auswählend ins Visier genommen gegen einen Krankheit verursachenden Organismus gemacht werden konnte, dann konnte ein Toxin für diesen Organismus zusammen mit dem Agenten der Selektivität geliefert werden. Er und Élie Metchnikoff haben den 1908-Nobelpreis für die Physiologie oder die Medizin für diese Arbeit erhalten, die zu einer wirksamen Syphilis-Behandlung vor 1910 geführt hat.

In den 1970er Jahren der B-Zellkrebs vielfacher myeloma war bekannt, und wurde es verstanden, dass diese krebsbefallenen B-Zellen alle einen einzelnen Typ des Antikörpers (ein Paraprotein) erzeugen. Das wurde verwendet, um die Struktur von Antikörpern zu studieren, aber es war noch nicht möglich, identische zu einem gegebenen Antigen spezifische Antikörper zu erzeugen.

Die Produktion von monoclonal Antikörpern, die Hybride-Zellen der menschlichen Maus einschließen, wurde von Jerrold Schwaber 1973 beschrieben und bleibt weit zitiert unter denjenigen, die von den Menschen abgeleiteten hybridomas verwenden, aber fordert zum Vorrang sind umstritten gewesen. Eine Wissenschaftsgeschichtszeitung auf dem Thema hat einen Kredit Schwaber gegeben, für eine Technik zu erfinden, die weit zitiert wurde, aber nicht so weit gegangen ist darauf hinzuweisen, dass er betrogen worden war. Die Erfindung wurde von George Pieczenik, mit John Sedat, dem Mann von Elizabeth Blackburn als ein Zeuge konzipiert und ist abgenommen, um sich durch Baumwolle und Milstein, und dann durch Kohler und Milstein zu üben. Georges Köhler, César Milstein und Niels Kaj Jerne 1975; wer den Nobelpreis in der Physiologie oder Medizin 1984 für die Entdeckung geteilt hat. Die Schlüsselidee war, eine Linie von myeloma Zellen zu verwenden, die ihre Fähigkeit verloren hatten, Antikörper zu verbergen, eine Technik zu präsentieren, um diese Zellen mit gesunden Antikörper erzeugenden B-Zellen zu verschmelzen und im Stande zu sein, für die erfolgreich verschmolzenen Zellen auszuwählen.

1988 haben Greg Winter und seine Mannschaft für die Techniken den Weg gebahnt, um monoclonal Antikörper zu humanisieren, die Reaktionen entfernend, die viele monoclonal Antikörper in einigen Patienten verursacht haben.

Produktion

Zellproduktion von Hybridoma

Antikörper von Monoclonal werden normalerweise durch das Schmelzen myeloma von Zellen mit den Milz-Zellen von einer Maus gemacht, die mit dem gewünschten Antigen immunisiert worden ist. Jedoch haben neue Fortschritte dem Gebrauch von Kaninchen-B-Zellen erlaubt, ein Kaninchen Hybridoma zu bilden.

Polyäthylen-Glykol wird verwendet, um angrenzende Plasmamembranen zu verschmelzen, aber die Erfolg-Rate ist so ein auswählendes Medium niedrig, in dem nur verschmolzene Zellen wachsen können, wird verwendet. Das ist möglich, weil myeloma Zellen die Fähigkeit verloren haben, hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase (HGPRT), ein für die Bergungssynthese von Nukleinsäuren notwendiges Enzym zu synthetisieren. Die Abwesenheit von HGPRT ist nicht ein Problem für diese Zellen, wenn der de novo purine Synthese-Pfad auch nicht gestört wird. Indem sie Zellen zu aminopterin (eine folic saure Entsprechung ausstellen, die dihydrofolate reductase, DHFR hemmt), sind sie unfähig, den de novo Pfad zu verwenden und völlig auxotrophic für Nukleinsäuren zu werden, die Ergänzung verlangen zu überleben.

Das auswählende Kulturmedium wird HUT-Medium genannt, weil es hypoxanthine, aminopterin, und thymidine enthält. Dieses Medium ist für verschmolzene (hybridoma) Zellen auswählend. Unverschmolzene myeloma Zellen können nicht wachsen, weil sie an HGPRT Mangel haben, und so ihre DNA nicht wiederholen können. Unverschmolzene Milz-Zellen können unbestimmt wegen ihrer beschränkten Lebensdauer nicht wachsen. Nur verschmolzene hybride Zellen, die auf als hybridomas verwiesen sind, sind im Stande, unbestimmt in den Medien zu wachsen, weil der Milz-Zellpartner HGPRT liefert und der Myeloma-Partner Charakterzüge hat, die ihn unsterblich machen (weil es eine Krebs-Zelle ist).

Diese Mischung von Zellen wird dann verdünnt, und Klone werden von einzelnen Elternteilzellen auf microtitre Bohrlöchern gewachsen. Die von den verschiedenen Klonen verborgenen Antikörper werden dann für ihre Fähigkeit geprüft, zum Antigen (mit einem Test wie ELISA oder Antigen-Mikroreihe-Feinprobe) oder Immuno-Punktklecks zu binden. Der produktivste und stabile Klon wird dann für den zukünftigen Gebrauch ausgewählt.

Der hybridomas kann unbestimmt in einem passenden Zellkulturmedium angebaut werden. Sie können auch in Mäuse (in der peritoneal Höhle eingespritzt werden, die Eingeweide umgebend). Dort erzeugen sie Geschwülste, die genannte ascites Flüssigkeit einer am Antikörper reichen Flüssigkeit verbergen.

Das Medium muss während in - vitro Auswahl bereichert werden, um weiter hybridoma Wachstum zu bevorzugen. Das kann durch den Gebrauch einer Schicht des Essers fibrocyte Zellen oder Ergänzungsmedium wie briclone erreicht werden. Durch macrophages bedingtes Kulturmedium kann auch verwendet werden. Die Produktion in der Zellkultur wird gewöhnlich bevorzugt, weil die ascites Technik zum Tier schmerzhaft ist. Wo abwechselnde Techniken bestehen, wird diese Methode (ascites) unmoralisch betrachtet.

Reinigung von monoclonal Antikörpern

Nach dem Erreichen entweder eine Mediaprobe von kultiviertem hybridomas oder eine Probe von ascites Flüssigkeit müssen die gewünschten Antikörper herausgezogen werden. Die Verseuchungsstoffe in der Zellkulturprobe würden in erster Linie aus Mediabestandteilen wie Wachstumsfaktoren, Hormone und transferrins bestehen. Im Gegensatz, in der vivo Probe wird wahrscheinlich Gastgeber-Antikörper haben, macht nucleases, Nukleinsäuren und Viren Spaß pro-. In beiden Fällen können andere Sekretionen durch den hybridomas wie cytokines da sein. Es kann auch Bakterienverunreinigung und, infolgedessen, endotoxins geben, die von den Bakterien verborgen werden. Abhängig von der Kompliziertheit der Medien, die in der Zellkultur, und so den fraglichen Verseuchungsstoffen erforderlich sind, kann eine Methode (in vivo oder in vitro) dem anderen vorzuziehend sein.

Die Probe wird zuerst bedingt, oder zur Reinigung bereit. Zellen, Zellschutt, lipids, und sind geronnen Material wird zuerst normalerweise durch centrifugation entfernt, der vom Filtrieren mit einem 0.45 µm Filter gefolgt ist. Diese großen Partikeln können ein Phänomen genannt Membran verursachen, die in späteren Reinigungsschritten schmutzig wird. Außerdem kann die Konzentration des Produktes in der Probe nicht besonders in Fällen genügend sein, wo der gewünschte Antikörper durch eine niedrig absondernde Zelllinie erzeugter derjenige ist. Die Probe wird deshalb durch das Ultrafiltrieren oder die Dialyse kondensiert.

Die meisten beladenen Unreinheiten sind gewöhnlich Anionen wie Nukleinsäuren und endotoxins. Diese werden häufig durch die Ion-Austauschchromatographie getrennt. Entweder Cation-Austauschchromatographie wird an einem genug niedrigen pH verwendet, den der gewünschte Antikörper zur Säule bindet, während Anionen fließen, oder Anion-Austauschchromatographie wird an einem genug hohen pH verwendet, dass der gewünschte Antikörper durch die Säule fließt, während Anionen dazu binden. Verschiedene Proteine können auch zusammen mit den Anionen getrennt werden, die auf ihrem Isoelectric-Punkt (Pi) gestützt sind. Zum Beispiel hat Albumin ein Pi 4.8, der bedeutsam niedriger ist als dieser von den meisten monoclonal Antikörpern, die ein Pi 6.1 haben. Mit anderen Worten, an einem gegebenen pH, wird die durchschnittliche Anklage von Albumin-Molekülen wahrscheinlich negativer sein. Transferrin hat andererseits ein Pi 5.9, so kann er nicht durch diese Methode leicht getrennt werden. Ein Unterschied im Pi von mindestens 1 ist für eine gute Trennung notwendig.

Transferrin kann stattdessen durch die Größe-Ausschluss-Chromatographie entfernt werden. Der Vorteil dieser Reinigungsmethode besteht darin, dass es eine der zuverlässigeren Chromatographie-Techniken ist. Da wir uns mit Proteinen befassen, entsprechen Eigenschaften wie Anklage und Sympathie nicht und ändern sich mit dem pH, weil Moleküle protonated und deprotonated sind, während Größe relativ unveränderlich bleibt. Dennoch hat es Nachteile wie niedrige Entschlossenheit, niedrige Kapazität und niedrige elution Zeiten.

Eine viel schnellere Einzelschrittmethode der Trennung ist Protein A/G Affinitätschromatographie. Der Antikörper bindet auswählend zum Protein A/G, so wird ein hohes Niveau der Reinheit (allgemein> 80 %) erhalten. Jedoch kann diese Methode für Antikörper problematisch sein, die leicht beschädigt werden, weil harte Bedingungen allgemein verwendet werden. Ein niedriger pH kann die Obligationen brechen, um den Antikörper von der Säule zu entfernen. Zusätzlich zum möglichen Beeinflussen des Produktes kann niedriger pH Protein A/G selbst veranlassen, von der Säule zu lecken und in der eluted Probe zu erscheinen. Sanfte elution Puffersysteme, die hohe Salz-Konzentrationen verwenden, sind auch verfügbar, um zu vermeiden, empfindliche Antikörper zum niedrigen pH auszustellen. Kosten sind auch eine wichtige Rücksicht mit dieser Methode, weil unbeweglich gemachtes Protein A/G ein teureres Harz ist.

Um maximale Reinheit in einem Einzelschritt zu erreichen, kann Sympathie-Reinigung mit dem Antigen durchgeführt werden, um exquisite Genauigkeit für den Antikörper zur Verfügung zu stellen. In dieser Methode ist das Antigen, das verwendet ist, um den Antikörper zu erzeugen, einer Agarose-Unterstützung beigefügter covalently. Wenn das Antigen ein peptide ist, wird es mit einem Terminal cysteine allgemein synthetisiert, der auswählende Verhaftung zu einem Transportunternehmen-Protein wie KLH während der Entwicklung und zur Unterstützung für die Reinigung erlaubt. Die Antikörper enthaltenden Medien werden dann mit dem unbeweglich gemachten Antigen entweder in der Gruppe ausgebrütet, oder weil der Antikörper durch eine Säule passiert wird, wo es auswählend bindet und behalten werden kann, während Unreinheiten abgewaschen werden. Ein elution mit einem niedrigen PH-Puffer oder einem sanfteren, hohen Salz elution Puffer wird dann verwendet, um gereinigten Antikörper von der Unterstützung wieder zu erlangen.

Um weiter für Antikörper auszuwählen, können die Antikörper mit dem Natriumssulfat oder Ammonium-Sulfat hinabgestürzt werden. Antikörper schlagen sich bei niedrigen Konzentrationen des Salzes nieder, während sich die meisten anderen Proteine bei höheren Konzentrationen niederschlagen. Das passende Niveau von Salz wird hinzugefügt, um die beste Trennung zu erreichen. Übersalz muss dann durch eine Entsalzen-Methode wie Dialyse entfernt werden.

Die Endreinheit kann mit einem Chromatogramm analysiert werden. Irgendwelche Unreinheiten werden Spitzen erzeugen, und das Volumen unter der Spitze zeigt den Betrag der Unreinheit an. Wechselweise können Gel-Elektrophorese und kapillare Elektrophorese ausgeführt werden. Unreinheiten werden Bänder der unterschiedlichen Intensität je nachdem erzeugen, wie viel der Unreinheit da ist.

Antikörper-Heterogenität

Produktheterogenität ist für den monoclonal Antikörper und die andere recombinant biologische Produktion üblich und wird normalerweise entweder stromaufwärts während des Ausdrucks oder stromabwärts während der Herstellung eingeführt.

Diese Varianten sind normalerweise Anhäufungen, deamidation Produkte, glycosylation Varianten, oxidierte Aminosäure-Seitenketten, sowie amino und carboxyl Endaminosäure-Hinzufügungen. Diese anscheinend Minutenänderungen in einer Struktur eines monoclonal Antikörpers können eine tiefe Wirkung auf vorklinische Stabilität und Prozessoptimierung sowie therapeutische Produktstärke, Bioverfügbarkeit und immunogenicity haben. Die allgemein akzeptierte Methode der Reinigung von Prozess-Strömen für monoclonal Antikörper schließt Festnahme des Produktziels mit dem Protein A, elution, Ansäuerung zu inactivate potenziellen Säugetierviren ein, die von der Cation-Austauschchromatographie, und schließlich Anion-Austauschchromatographie gefolgt sind.

Versetzungschromatographie ist verwendet worden, um diese häufig ungesehene Varianten in Mengen zu identifizieren und zu charakterisieren, die für nachfolgende vorklinische Einschätzungsregierungen wie Tier pharmacokinetic Studien passend sind. Während der vorklinischen Entwicklungsphase gewonnene Kenntnisse sind für das erhöhte Verstehen der Produktqualität kritisch und schaffen eine Grundlage für das Risikomanagement und haben Durchführungsflexibilität vergrößert. Die Qualität der neuen Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimittlel durch die Designinitiative versucht, Leitung auf der Entwicklung zur Verfügung zu stellen und Design von Produkten und Prozessen zu erleichtern, der Wirkungs- und Sicherheitsprofil maximiert, während er Produkt manufacturability erhöht.

Recombinant

Die Produktion von recombinant monoclonal Antikörper ist mit Technologien, gekennzeichnet als Repertoire-Klonen oder phage Anzeige der Anzeige/Hefe verbunden. Antikörper-Technik von Recombinant ist mit dem Gebrauch von Viren oder Hefe verbunden, um Antikörper, aber nicht Mäuse zu schaffen. Diese Techniken verlassen sich auf das schnelle Klonen von immunoglobulin Gensegmenten, um Bibliotheken von Antikörpern mit ein bisschen verschiedenen Aminosäure-Folgen zu schaffen, von denen Antikörper mit der gewünschten Genauigkeit ausgewählt werden können. Die phage Antikörper-Bibliotheken sind eine Variante der phage Antigen-Bibliotheken, die zuerst von George Pieczenik http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/archive/g_pieczenik.html erfunden sind, Diese Techniken können verwendet werden, um die Genauigkeit zu erhöhen, mit der Antikörper Antigene, ihre Stabilität in verschiedenen Umweltbedingungen, ihre therapeutische Wirkung und ihren detectability in diagnostischen Anwendungen anerkennen. Gärungsräume sind verwendet worden, um diese Antikörper auf einem in großem Umfang zu erzeugen.

Schimärische Antikörper

Bald bestand ein Hauptproblem für den therapeutischen Gebrauch von monoclonal Antikörpern in der Medizin darin, dass anfängliche Methoden gepflegt haben, sie nachgegebene Maus, nicht menschliche Antikörper zu erzeugen. Während strukturell ähnlich, sind Unterschiede zwischen den zwei genügend, um eine geschützte vorgekommene Antwort anzurufen, als murine monoclonal Antikörper in Menschen eingespritzt und ihre schnelle Eliminierung vom Blut, den entzündlichen Körpereffekten und der Produktion von menschlichen Antimaus-Antikörpern (HAMA) hinausgelaufen wurden.

Um dieses Hindernis zu überwinden, sind Annäherungen mit recombinant DNA seit dem Ende der 1980er Jahre erforscht worden. In einer Annäherung wurde Maus-DNA, die den verbindlichen Teil eines monoclonal Antikörpers verschlüsselt, mit der menschlichen Antikörper erzeugenden DNA in lebenden Zellen verschmolzen, und der Ausdruck dieser schimärischen DNA durch die Zellkultur hat teilweise Maus, teilweise menschlichen monoclonal Antikörper nachgegeben. Für dieses Produkt, die beschreibenden Begriffe "schimärischer" und "humanisierter" monoclonal Antikörper sind verwendet worden, um die Kombination der Maus und im Recombinant-Prozess verwendeten Quellen der menschlichen DNA zu widerspiegeln.

'Völlig' menschliche monoclonal Antikörper

Seitdem die Entdeckung, dass monoclonal Antikörper in - vitro, Wissenschaftler erzeugt werden konnten, die Entwicklung von 'völlig' menschlichen Antikörpern ins Visier genommen hat, um einige der Nebenwirkungen von humanisierten und schimärischen Antikörpern zu vermeiden. Zwei erfolgreiche Annäherungen wurden — phage anzeigeerzeugte Antikörper und Mäuse identifiziert, die genetisch konstruiert sind, um mehr einem Menschen ähnliche Antikörper zu erzeugen.

Eine der erfolgreichsten kommerziellen Organisationen hinter therapeutischen monoclonal Antikörpern war Cambridge Antibody Technology (CAT). Wissenschaftler am computerunterstützten Testen haben demonstriert, dass Phage-Anzeige solch verwendet werden konnte, dass variable Antikörper-Gebiete auf filamentous phage Antikörper ausgedrückt werden konnten. Das wurde in einer Schlüsselnatur-Veröffentlichung berichtet.

Andere bedeutende Veröffentlichungen schließen ein:

Computerunterstütztes Testen hat ihre Anzeigetechnologien weiter in mehrere, patentierte Antikörper-Entdeckung genomics Werkzeuge / funktionelle genomics Werkzeuge entwickelt, die Proximol und ProAb genannt wurden. ProAb wurde im Dezember 1997 bekannt gegeben und Highthroughput-Abschirmung von Antikörper-Bibliotheken gegen das kranke und nichtkranke Gewebe beteiligt, während Proximol eine freie radikale enzymatische Reaktion verwendet hat, Moleküle in der Nähe zu einem gegebenen Protein zu etikettieren.

Genetisch konstruierte Mäuse, so genannte transgenic Mäuse, können modifiziert werden, um menschliche Antikörper zu erzeugen, und das ist von mehreren kommerziellen Organisationen ausgenutzt worden:

• Medarex — die ihre Plattform von UltiMab auf den Markt bringen
• Abgenix — wer ihre Technologie von Xenomouse auf den Markt gebracht hat. Abgenix wurden im April 2006 von Amgen erworben.
• Die Technologie von VelocImmune von Regeneron.

Antikörper von Monoclonal sind erzeugt und genehmigt worden, um zu behandeln: Krebs, kardiovaskuläre Krankheit, entzündliche Krankheiten, macular Entartung,

Verpflanzungsverwerfung, multiple Sklerose und Vireninfektion (sieh monoclonal Antikörper-Therapie).

Im August 2006 haben die Pharmazeutische Forschung und Hersteller Amerikas berichtet, dass amerikanische Gesellschaften 160 verschiedene monoclonal Antikörper in klinischen Proben oder Erwarten-Billigung durch die Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimittlel hatten.

Anwendungen

Diagnostische Tests

Einmal monoclonal Antikörper für eine gegebene Substanz sind erzeugt worden, sie können verwendet werden, um die Anwesenheit dieser Substanz zu entdecken. Der Westklecks-Test und die Immuno-Punktklecks-Tests entdecken das Protein auf einer Membran. Sie sind auch in immunohistochemistry sehr nützlich, die Antigen in festen Gewebeabteilungen und Immunofluorescence-Test entdecken, die die Substanz in einer eingefrorenen Gewebeabteilung oder in lebenden Zellen entdecken.

Therapeutische Behandlung

Krebs-Behandlung

Eine mögliche Behandlung für Krebs ist mit monoclonal Antikörpern verbunden, die nur zu Krebs zellspezifische Antigene binden und eine immunologische Antwort gegen die Zielkrebs-Zelle veranlassen. Solcher mAb konnte auch für die Übergabe eines Toxins, Radioisotops, cytokine oder anderen aktiven verbundenen modifiziert werden; es ist auch möglich, bispecific Antikörper zu entwerfen, die mit ihren Gebieten von Fab binden können, sowohl um Antigen als auch zu einer verbundenen Zelle oder Effektor-Zelle ins Visier zu nehmen. Tatsächlich kann jeder intakte Antikörper zu Zellempfängern oder anderen Proteinen mit seinem Gebiet von Fc binden.

Die Illustration zeigt unten alle diese Möglichkeiten:

Durch den FDA genehmigte MAbs schließen ein

• Bevacizumab
• Cetuximab
• Panitumumab
• Trastuzumab

Autogeschützte Krankheiten

Für autogeschützte Krankheiten verwendete Antikörper von Monoclonal schließen infliximab und adalimumab ein, die in rheumatischer Arthritis, der Krankheit von Crohn und Geschwürkolik durch ihre Fähigkeit wirksam sind, zu binden zu und TNF-α zu hemmen. Basiliximab und daclizumab hemmen IL-2 auf aktivierten T Zellen und helfen dadurch, akute Verwerfung von Niereverpflanzungen zu verhindern. Omalizumab hemmt menschlichen immunoglobulin E (IgE) und ist in gemäßigtem-zu-streng allergischem Asthma nützlich.

Beispiele

Unten sind Beispiele klinisch wichtiger monoclonal Antikörper.

Siehe auch

• Antikörper mimetic
• Immunotoxins, die manchmal monoclonal Antikörper als der Zielen-Mechanismus verwenden
• Liste von monoclonal Antikörpern
• Antikörper-Therapie von Monoclonal
• Nomenklatur von monoclonal Antikörpern
• Antikörper von Polyclonal
• Königin Mab Small mythologische Zahl, die Hoffnung (populäre Kultur, verwendet als biotech Wortspiel) symbolisiert.

Verweisung 24: Sollte sein

Kapitel 34. Therapeutische Antikörper und Immunologic paaren Sich. In Klinischem Oncology, 4. Ausgabe, die von Abeloff MD, Armitage JO, Niederhuber JE, Kastan MB and McKenna G. Publisher Elsevier Inc. 2008 editiert ist.

Außenverbindungen

• Monoclonal Antikörper-Zeichentrickfilm (Blitz erforderlich)
• Monoclonal Antikörper, aus dem Online-Biologie-Lehrbuch von John W. Kimball