Phenylalanine hydroxylase (PheOH, wechselweise PheH oder PAH) ist ein Enzym, das den hydroxylation der aromatischen Seitenkette von phenylalanine katalysiert, um tyrosine zu erzeugen. PheOH ist eines von drei Mitgliedern der pterin-abhängigen Aminosäure hydroxylases, einer Klasse von monooxygenase, der tetrahydrobiopterin (BH, ein pteridine cofactor) und ein non-heme Eisen für die Katalyse verwendet. Während der Reaktion ist molekularer Sauerstoff heterolytically, der mit der folgenden Integration eines Sauerstoff-Atoms in BH und phenylalanine Substrat zerspaltet ist.

Phenylalanine hydroxylase ist das Rate beschränkende Enzym des metabolischen Pfads, der Übermaß phenylalanine erniedrigt. Die Forschung über phenylalanine hydroxylase durch Seymour Kaufman hat zur Entdeckung von tetrahydrobiopterin als ein biologischer cofactor geführt. Das Enzym ist auch von einer menschlichen Gesundheitsperspektive interessant, weil Veränderungen in PAH, dem Verschlüsselungsgen, zu phenylketonuria, einer strengen metabolischen Unordnung führen können.

Enzym-Mechanismus

Wie man

denkt, geht die Reaktion durch die folgenden Schritte weiter:

1. Bildung von Fe (II)-o-o-bh Brücke.
2. Heterolytic-Spaltung des O-O Bandes, um den ferryl oxo hydroxylating Zwischenfe (IV) =O nachzugeben
3. Angriff auf Fe (IV) =O zu hydroxylate phenylalanine Substrat zu tyrosine.

Bildung und Spaltung der Eisen-Peroxypterin Brücke. Obwohl Beweise stark Fe (IV) =O als das hydroxylating Zwischenglied unterstützen, bleiben die mechanistischen Details, die der Bildung von Fe (II)-o-o-bh Brücke vor der heterolytic Spaltung unterliegen, umstritten. Zwei Pfade sind gestützt auf Modellen vorgeschlagen worden, die sich in der Nähe des Eisens zum pterin cofactor und der Zahl von Wassermolekülen unterscheiden, die angenommen sind, während der Katalyse eisenkoordiniert zu werden. Gemäß einem Modell wird ein Eisen dioxygen Komplex am Anfang gebildet und als eine Klangfülle-Hybride von FeO und FeO stabilisiert. Der aktivierte O greift dann BH an, einen Übergang-Staat bildend, der durch die Anklage-Trennung zwischen dem elektronunzulänglichen Pterin-Ring und den elektronreichen dioxygen Arten charakterisiert ist. Fe (II)-o-o-bh4 Brücke wird nachher gebildet. Andererseits ist die Bildung dieser Brücke modelliert worden annehmend, dass BH4 in der ersten Koordinationsschale von Eisen gelegen wird, und dass das Eisen zu keinen Wassermolekülen koordiniert wird. Dieses Modell sagt einen verschiedenen Mechanismus voraus, der einen pterin Radikalen und Superoxyd als kritische Zwischenglieder einbezieht. Einmal gebildet wird Fe (II)-o-o-bh Brücke heterolytic Spaltung des O-O Bandes zu Fe (IV) =O und 4a-hydroxytetrahydrobiopterin durchbrochen; so ist molekularer Sauerstoff die Quelle sowohl von Sauerstoff-Atomen, die an hydroxylate der Pterin-Ring als auch von phenylalanine verwendet sind.

Hydroxylation von phenylalanine durch ferryl oxo Zwischenglied. Weil der Mechanismus Fe (IV) =O (im Vergleich mit einem peroxypterin) hydroxylating Zwischenglied einschließt, kann die Oxydation des BH cofactor und hydroxylation von phenylalanine decoupled sein, auf unproduktiven Verbrauch von BH4 und Bildung von H2O2 hinauslaufend. Wenn produktiv, aber wird Fe (IV) =O Zwischenglied zu phenylalanine in einer electrophilic aromatischen Ersatz-Reaktion hinzugefügt, die Eisen vom ferryl bis den Eisenstaat reduziert. Obwohl am Anfang ein arene radikales oder Oxydzwischenglied vorgeschlagen wurde, haben Analysen des zusammenhängenden tryptophan und tyrosine hydroxylases darauf hingewiesen, dass die Reaktion stattdessen durch ein cationic Zwischenglied weitergeht, das verlangt, dass Fe (IV) =O zu einem Wasser ligand aber nicht einer hydroxo Gruppe koordiniert wird. Dieses cationic Zwischenglied erlebt nachher eine 1,2-hydride NIH-Verschiebung, ein dienone Zwischenglied dass dann tautomerizes nachgebend, um das tyrosine Produkt zu bilden. Der pterin cofactor wird durch die Hydratation des carbinolamine Produktes von PheOH zu quinonoid dihydrobiopterin (qBH) regeneriert, der dann auf BH reduziert wird.

Enzym-Regulierung

Dieses Protein kann das morpheein Modell der allosteric Regulierung verwenden.

Struktur

PheOH monomer (51.9 kDa) besteht aus drei verschiedenen Gebieten: ein DurchführungsN-Endgebiet (Rückstände 1-117), das katalytische Gebiet (Rückstände 118-427) und ein C-Endgebiet (Rückstände 428-453) verantwortlich für oligomerization von identischem monomers. Umfassende crystallographic Analyse, ist besonders auf dem pterin- und eisenkoordinierten katalytischen Gebiet durchgeführt worden, um die aktive Seite zu untersuchen. Die Struktur des N-Terminals Durchführungsgebiet ist auch, und zusammen mit der gelösten Struktur des homologen tyrosine hydroxylase C-Terminal tetramerization Gebiet, ein Strukturmodell von tetrameric PheOH bestimmt worden, ist vorgeschlagen worden.

Katalytisches Gebiet

Gelöste Kristallstrukturen des katalytischen Gebiets zeigen an, dass die aktive Seite aus einer offenen und geräumigen Tasche liniert in erster Linie durch hydrophobe Rückstände besteht, obwohl drei glutamic saure Rückstände, zwei histidines und ein tyrosine auch da sind und für pterin- und Eisenschwergängigkeit kritisch sind. Widersprechende Beweise bestehen über den Koordinationsstaat des Eisenatoms und seine Nähe zu BH4 innerhalb der aktiven Seite. Gemäß der crystallographic Analyse wird Fe (II) durch Wasser, His285, His290 und Glu330 (2 seine 1 carboxylate Gesichtstriade-Einordnung) mit der octahedral Geometrie koordiniert. Die Einschließung einer Entsprechung von Phe in der Kristallstruktur ändert sowohl Eisen von sechs - zu einem fünf koordinierten Staat, der ein einzelnes Wassermolekül als auch bidentate Koordination zu Glu330 einschließt und eine Seite für Sauerstoff öffnet, um zu binden. BH4 ist zum Eisenatom ausgewechselter concommitantly, obwohl der pterin cofactor im zweiten Koordinationsbereich bleibt. Andererseits weist ein konkurrierendes Modell, das auf NMR und molekularen modellierenden Analysen gestützt ist, darauf hin, dass alle koordinierten Wassermoleküle aus der aktiven Seite während des katalytischen Zyklus gezwungen werden, während BH4 direkt koordiniert für Eisen wird. Wie besprochen, oben, diese Diskrepanz auflösend, wird wichtig sein, für den genauen Mechanismus der Katalyse von PheOH zu bestimmen.

N-Terminal Durchführungsgebiet

Die Durchführungsnatur des N-Endgebiets (Rückstände 1-117) wird durch seine Strukturflexibilität zugeteilt. Austauschanalyse des Wasserstoffs/schweren Wasserstoffs zeigt an, dass die Allosteric-Schwergängigkeit von Phe allgemein die Angleichung von solchem PheOH verändert, dass die aktive Seite weniger verschlossen wird, weil die Schnittstelle zwischen den regelnden und katalytischen Gebieten zum Lösungsmittel zunehmend ausgestellt wird. Diese Beobachtung ist mit kinetischen Studien im Einklang stehend, die einen am Anfang niedrigen Zinssatz der tyrosine Bildung für lebensgroßen PheOH zeigen. Diese Verzögerungszeit wird jedoch für gestutzten PheOH nicht beobachtet, der am N-Endgebiet Mangel hat, oder wenn das lebensgroße Enzym mit Phe vorausgebrütet wird. Das Auswischen des N-Endgebiets beseitigt auch die Verzögerungszeit, während es die Sympathie für Phe durch fast zweifachen vergrößert; kein Unterschied wird in den V oder K für den tetrahydrobiopterin cofactor beobachtet. Zusätzliche Regulierung wird durch Ser16 zur Verfügung gestellt; phosphorylation dieses Rückstands verändert Enzym-Angleichung nicht, aber reduziert wirklich die Konzentration von für die allosteric Aktivierung erforderlichem Phe. Dieses N-Terminal wird Durchführungsgebiet in bakteriellem PheOHs nicht beobachtet, aber zeigt beträchtliche Strukturhomologie zum Durchführungsgebiet von phosphogylcerate dehydrogenase, einem Enzym im serine biosynthetic Pfad.

Gebiet von Tetramerization

Prokaryotic PheOH ist monomeric, wohingegen eukaryotic PheOH in einem Gleichgewicht zwischen homotetrameric und Homodimeric-Formen besteht. Die Dimerization-Schnittstelle wird aus Symmetrie-zusammenhängenden Schleifen zusammengesetzt, die identischen monomers verbinden, während das überlappende C-Terminal tetramerization Gebiet die Vereinigung von conformationally verschiedenen dimers vermittelt, die durch eine verschiedene Verhältnisorientierung der katalytischen und tetramerization Gebiete (Flatmark, Erlandsen) charakterisiert werden. Die resultierende Verzerrung der tetramer Symmetrie ist in der Differenzialfläche des dimerization offensichtlich verbindet und unterscheidet PheOH vom tetramerically symmetrischen tyrosine hydroxylase. Ein bereichstauschender Mechanismus ist vorgeschlagen worden, um Bildung des tetramer von dimers zu vermitteln, in dem C-Endalpha-Spiralen gegenseitig ihre Angleichung um ein flexibles C-Terminal Fünf-Rückstände-Scharnier-Gebiet verändern, um eine Struktur der aufgerollten Rolle zu bilden, Gleichgewicht zur Tetrameric-Form auswechselnd. Obwohl sowohl der homodimeric als auch die Homotetrameric-Formen von PheOH, die zwei Ausstellungsstück-Differenzialkinetik und Regulierung katalytisch aktiv sind. Zusätzlich zur reduzierten katalytischen Leistungsfähigkeit zeigt der dimer positiven cooperativity zu L-Phe nicht (der bei hohen Konzentrationen das Enzym aktiviert), darauf hinweisend, dass L-Phe allosterically PheOH durch das Beeinflussen dimer-dimer der Wechselwirkung regelt.

Biologische Funktion

PheOH ist ein kritisches Enzym im phenylalanine Metabolismus und katalysiert den Rate beschränkenden Schritt in seinem ganzen Katabolismus zum Kohlendioxyd und Wasser. Die Regulierung des Flusses durch phenylalanine-verbundene Pfade ist im Säugetiermetabolismus, wie gezeigt, durch die Giftigkeit von hohen Plasmaniveaus dieser in phenylketonuria beobachteten Aminosäure kritisch (sieh unten.) Ist die Hauptquelle von phenylalanine aufgenommene Proteine, aber relativ wenig von dieser Lache wird für die Protein-Synthese verwendet. Statt dessen ist die Mehrheit von aufgenommenem phenylalanine catabolized durch PheOH, um tyrosine zu bilden; die Hinzufügung der hydroxyl Gruppe berücksichtigt den in nachfolgenden Catabolic-Schritten zu brechenden Benzol-Ring. Transamination zu phenylpyruvate, dessen metabolites excreted im Urin sind, vertritt einen anderen Pfad des phenylalanine Umsatzes, aber der Katabolismus durch PheOH herrscht vor.

In Menschen wird dieses Enzym sowohl in der Leber als auch in der Niere ausgedrückt, und es gibt eine Anzeige, dass es in diesen Geweben unterschiedlich geregelt werden kann. PheOH ist unter der aromatischen Aminosäure hydroxylases für seine Beteiligung am Katabolismus ungewöhnlich; tyrosine und tryptophan hydroxylases werden in erster Linie andererseits im Zentralnervensystem ausgedrückt und katalysieren Rate beschränkende Schritte in der neurotransmitter/hormone Biosynthese.

Krankheitsrelevanz

Der Mangel in der Tätigkeit von PheOH wegen Veränderungen im PAH Gen verursacht hyperphenylalaninemia (HPA), und wenn Blut phenylalanine Niveaus über 20mal der normalen Konzentration, die metabolische Krankheit phenylketonuria (PKU) Ergebnisse zunimmt. PKU ist sowohl genotypisch als auch phenotypically heterogen: Mehr als 300 verschiedene pathologische Mutanten sind erkannt worden, dessen Mehrheit missense Veränderungen entsprechen, die zum katalytischen Gebiet kartografisch darstellen. Als eine Kohorte von erkannten Mutanten von PheOH in recombinant Systemen ausgedrückt wurde, haben die Enzyme verändertes kinetisches Verhalten gezeigt und/oder haben Stabilität reduziert, die damit im Einklang stehend ist, dieser Veränderungen sowohl zu den katalytischen als auch zu tetramerization Gebieten des Enzyms strukturell kartografisch darzustellen. Interessanterweise ist BH4 als eine pharmakologische Behandlung verwaltet worden und ist gezeigt worden, Blutniveaus von phenylalanine für ein Segment von PKU Patienten zu reduzieren, deren Genotypen zu etwas restlicher PAH Tätigkeit führen, aber keinen Defekt in der BH4 Synthese oder Regeneration haben. Anschlußstudien weisen darauf hin, dass im Fall von bestimmten Mutanten von PheOH überschüssiger BH4 als eine pharmakologische Anstandsdame handelt, um Mutationsenzyme mit dem gestörten tetramer Zusammenbau und der vergrößerten Empfindlichkeit zur proteolytic Spaltung und Ansammlung zu stabilisieren. Veränderungen, die im PAH geometrischen Ort identifiziert worden sind, werden am Phenylalanine Hydroxylase Geometrischen Ort Knowledgbase (PAHdb, http://www.pahdb.mcgill.ca/) dokumentiert.

Da phenylketonurea irreversiblen Schaden verursachen kann, ist es befehlend, dass Mängel in Phenylalanine Hydroxylase bald in der Entwicklung bestimmt werden. Eine Methode ist ein als der Test von Guthrie bekannter Postgebären-Abschirmungstest. Die übliche Methodik ist über die Zeichnung des Bluts von einem kleinen Nadel-Stich an der Ferse des Neugeborenen und der Prüfung davon für phenylketonurea, der für einen PH-Mangel bezeichnend ist. Wenn sie die Person auf einem niedrigen phenylalanine legt, kann hohe tyrosine Diät helfen, jeden langfristigen Schaden an ihrer Entwicklung zu verhindern.

Zusammenhängende Enzyme

Phenylalanine hydroxylase ist nah mit zwei anderen Enzymen verbunden:

• tryptophan hydroxylase (Nummer 1.14.16.4 der europäischen Gemeinschaft), der Niveaus von serotonin im Gehirn und der gastrointestinal Fläche kontrolliert
• tyrosine hydroxylase (Nummer 1.14.16.2 der europäischen Gemeinschaft), der Niveaus von dopamine, epinephrine, und norepinephrine im Gehirn und dem Nebennierenknochenmark kontrolliert.

Die drei Enzyme sind homolog, d. h. werden gedacht, sich von demselben alten hydroxylase entwickelt zu haben.

Weiterführende Literatur